[發明專利]一種異香豆素類化合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510788927.0
• 申請日: 2015-11-17
• 公開（公告）號: CN105481817B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 周敏;耿慧春;李忠;葉艷青;胡秋芬;李干鵬;杜剛;楊海英
• 申請（專利權）人: 云南民族大學
• 主分類號: C07D311/76
• 分類號: C07D311/76;A61P31/14;C12P17/06;C12R1/69
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業)53116
• 代理人: 謝喬良,王遠同

1.一種異香豆素類化合物，其特征在于所述的異香豆素類化合物是以百合科植物滇重樓 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 中得到的曲霉屬真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)為基礎，經菌種分離、菌種培養、規模化發酵、有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析富集、高壓液相色譜分離獲得，其分子式為C₁₆H₁₈O₅，命名為米曲霉素B，英文名為oryzaeins B，其結構式為：

。

2.一種權利要求1所述的異香豆素類化合物的制備方法，其特征在于是以百合科植物滇重樓 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 中得到的曲霉屬真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)為基礎，經菌種分離、菌種培養、規模化發酵、有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析富集、高壓液相色譜分離步驟獲得，具體為：

A、內生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分離：將75%乙醇消毒后的百合科重樓屬滇重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖稈和/或葉片放入無菌的研缽中進行研磨，研磨后轉入無菌的塑料管內，1000~3000 rpm離心2~10min，吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培養箱中，25~30攝氏度黑暗培養2~10天，反復挑取單菌落培養并編號保存菌種，直到獲得單一內生真菌菌落，經ITS測序確定為曲霉屬真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)；

B、內生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌種培養：A步驟分離得到的米曲霉菌種在室溫下接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，25~30℃培養7~10天，再接種在50~500毫升的三角瓶中，每個三角瓶含10~100毫升馬鈴薯葡萄糖培養基，置于25~30攝氏度下震蕩培養5~10天得到液體發酵種子；

C、米曲霉(Aspergillus oryzae)的規模化發酵：將B步驟培養得到的的液體發酵種子進行規模化發酵，規模化發酵是在100~1000個100~500mL 的馮巴赫瓶中進行，每個瓶含有10~200g大米和10~200mL 蒸餾水，每個瓶中接種1.0~5.0mL 步驟B培養得到的液體發酵種子，于25~30℃培養15~45天得到米曲霉發酵物；

D、浸膏提取：將C步驟發酵得到的米曲霉發酵物用有機溶劑超聲提取2~5次，每次30~60min，合并提取液后過濾提取液，減壓濃縮，靜置，濾除沉淀物，濃縮得到浸膏a；

E、硅膠柱層析：將D步驟所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為200~300目，用量為浸膏a重量的6~10倍量；用體積配比為20:1~0:1的混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經TLC或分析型HPLC監測，合并相同的部分；

F、反相柱層析：將E步驟中8:2配比的混合有機溶劑進行洗脫得到的洗脫液上反相柱層析，反相柱是用反相材料C-18裝柱；用體積濃度為20~80%的甲醇溶液進行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經TLC監測，合并相同的部分；

G、高效液相色譜分離：將以體積濃度50~70%甲醇溶液洗脫得到的洗脫液經高效液相色譜分離純化，即得所述的異香豆素類化合物米曲霉素B，英文名為oryzaeins B。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于A步驟中所述的研磨是將75%乙醇消毒后的百合科重樓屬滇重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖稈和葉片放入無菌的研缽中，加入莖稈和葉片總重量0.5~1.0倍的水、再加入莖稈和葉片總重量1.0~2.0倍的石英砂進行研磨。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于D步驟中所述的有機溶劑為體積百分濃度70~100%的丙酮、體積百分濃度90~100%的乙醇、體積百分濃度90~100%的乙酸乙酯或體積百分濃度90~100%的甲醇。