[發明專利]一種新型磷脂酶

有效

• 申請號: 201510778847.7
• 申請日: 2015-11-13
• 公開（公告）號: CN106701712B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 戴小軍;蘇斐;牛其文
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

本發明涉及一種新的磷脂酶及其編碼基因。還涉及包含所述基因的載體以及宿主細胞。本發明提供的磷脂酶包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列經過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。本發明提供的磷脂酶具有水解磷脂酰乙醇胺酰基酯但不水解磷脂酰膽堿的能力。

技術領域

本發明涉及一種新型磷脂酶及其編碼基因。還涉及包含所述基因的載體以及宿主細胞。

背景技術

磷脂酶是水解磷脂的酶，根據水解位置不同分為幾種大類。磷脂酶A1(PLA1)水解游離出sn-1位的脂肪酸；磷脂酶A2(PLA2)水解釋放出sn-2位的脂肪酸；磷脂酶B(PLB)水解釋放出sn-1及sn-2位的脂肪酸；磷脂酶C(PLC)水解甘油-磷酸酯鍵，釋放出二酰基甘油和磷酸酯；磷脂酶D(PLD)水解磷酸-堿酯鍵，釋放出磷脂酸和堿(膽堿、乙醇胺或肌醇)。磷脂酶廣泛使用在磷脂去除、磷脂改性等方面。

卵磷脂(磷脂酰膽堿，Phosphatidyl choline，PC)是使用最普遍的磷脂。它是天然的表面活性劑，具有多種重要的生理功能，在乳化機、潤濕劑、分散劑、穩定劑、藥物載體以及直接用于治療心血管疾病方面使用廣泛。卵磷脂主要來自大豆和蛋黃。工業級卵磷脂大部分來自毛油脫膠后產生的油腳，大豆產量豐富而且大豆卵磷脂中不飽和脂肪酸含量比蛋黃卵磷脂高。但油腳中除了卵磷脂外，還存在腦磷脂(磷脂酰乙醇胺，Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸、脂肪酸鹽、中性油、蛋白質及其他雜質。治療、精細化工、藥物載體甚至高級食品都需要純度很高的卵磷脂，但卵磷脂一般都與其他磷脂共同存在，并有類似的溶解性質，分離困難。從大豆制備卵磷脂，一般先制得粗磷脂，然后按需要進行純化。目前卵磷脂的純化有⑴溶劑法；⑵金屬鹽沉淀法；⑶超臨界萃取法；⑷薄層色譜法；⑸柱層析法；⑹膜分離法。[磷脂酰膽堿的提取、純化和分析研究，羅珍，碩士論文]。其中工業上最常用是乙醇浸提法[高純卵磷脂的分離提純方法,張秀青、于才淵，糧油加工與食品機械，2006,4期，45-48]，PC溶于乙醇，PE溶于熱乙醇[磷脂算的提取純化與生理活性分析，論文]，但乙醇富集也僅能將PC含量濃縮到45.3％[大豆磷脂酰膽堿的提取純化研究，葛玉卿，論文]需要再經過柱層析才能達到95％的純度。如果有能水解腦磷脂但不水解卵磷脂的酶，顯然可以使得卵磷脂的純化更加簡單、低耗、低污染。

甘油磷酸乙醇胺(GPE)是體內天然存在的水溶性磷脂代謝產物，主要存在于大腦及肝臟中，是生物體內PC、PE、PS等磷脂成分生物合成的重要前體。在實驗室的動物試驗中，GPE表現出了顯著地提高記憶力以及學習模仿能力的作用，在人體的臨床試驗中，它對心理智能測試的結果、常用的神經尺度測量結果以及神經生理學參數均產生了一定的影響。它能治療人體的各種神經和心理功能缺陷方面的疾病，如心理活動緩慢、記憶力隨著年齡增長而下降，以及情緒不穩、心理比較脆弱等方面的疾病。因此，GPE常用作藥物的主要有效成分，與適當的載體相互輔助，用于治療由于大腦退化或腦血管功能不全引起的慢性腦部神經組織綜合癥。目前磷脂中PC、PE混雜，很難區分，因此制備純的GPE很難，一般通過甲醇鈉催化PC、PE混合物醇解，然后通過離子交換樹脂分離出GPE，效率很低。如果有轉一性水解腦磷脂的酶，即可利用它來水解混合磷脂，釋放出GPE來。制備工作更加簡單高效。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的磷脂酶，該酶具有磷脂酰乙醇胺酰基酯水解活力但不具備磷脂酰膽堿的水解活力。其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列經過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，所述取代優選為氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。