[發(fā)明專利]一種催化甲醇制備異戊二烯的大腸桿菌基因工程菌及其制備方法與應用

有效

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• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN105255804B
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 咸漠;唐勇;趙廣;廖本仁;馮新軍;揭元萍;劉會洲;張春雷
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所;上海華誼（集團）公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發(fā)明公開了一種催化甲醇制備異戊二烯的大腸桿菌基因工程菌及其制備方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明所提供的大腸桿菌基因工程菌具有異戊二烯合成途徑，同時過表達甲醇脫氫酶基因MDH，6?磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6?磷酸?3?己酮糖異構酶基因RmpB和甲醇脫氫酶激活蛋白基因Act。同時，本發(fā)明還提供了構建該大腸桿菌基因工程菌的方法及應用方法。本發(fā)明所提供的大腸桿菌基因工程菌可以甲醇為底物生物合成異戊二烯，具有轉(zhuǎn)化效率高，生產(chǎn)成本低等特點，甲醇?異戊二烯的轉(zhuǎn)化率可達21.83％。

技術領域

本發(fā)明涉及一種催化甲醇制備異戊二烯的大腸桿菌基因工程菌及其制備方法與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

中國是世界甲醇大國，產(chǎn)能超過世界的50％，2014年國內(nèi)產(chǎn)能超過6000萬噸，2015年預計會超過6500萬噸。根據(jù)國際經(jīng)驗，產(chǎn)能利用率保持在81％～82％之間是衡量工業(yè)產(chǎn)能是否過剩的臨界點。從近年來國內(nèi)甲醇行業(yè)平均開工率數(shù)據(jù)來看，我國甲醇開工率一直在60％以下，2013年甲醇平均開工率為57.13％，處于嚴重過剩的狀態(tài)。國內(nèi)甲醇產(chǎn)能過剩，加上進口甲醇價格較低，致使國內(nèi)甲醇的價格持續(xù)下降，2014年維持在1500～2000元/噸左右。

甲醇精細化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，能夠有效應對甲醇生產(chǎn)過剩的局面，對于我國甲醇工業(yè)行業(yè)的發(fā)展和市場的深化拓展有著重要意義。下游產(chǎn)品比之甲醇有更多的發(fā)展空間，能夠生產(chǎn)出更多的分支產(chǎn)品，而且下游產(chǎn)品在環(huán)保和節(jié)能方面與甲醇相比更具優(yōu)勢，更符合世界工業(yè)的新理念。基于以上優(yōu)點，大力研發(fā)甲醇下游產(chǎn)品，生產(chǎn)高附加值的精細化工產(chǎn)品是甲醇類產(chǎn)品發(fā)展的大趨勢。

甲醇的下游產(chǎn)品開發(fā)可以通過化學轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)化另種方法實現(xiàn)。化學轉(zhuǎn)化途徑，研究較多的是以甲醇為原料制取烯烴、二甲醚、乙酸和甲醛等附加值較低的物質(zhì)。化學轉(zhuǎn)化離不開貴金屬催化劑，提高了生產(chǎn)升本。同時，催化劑的選擇性和原料的轉(zhuǎn)化率較低、副產(chǎn)物較多、污染嚴重等問題的存在嚴重制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。相比較而言，生物方法污染小、成本較低、可以實現(xiàn)原料的高效轉(zhuǎn)化。

甲醇的生物轉(zhuǎn)化利用處于探索階段。以甲醇為碳源，通過微生物轉(zhuǎn)化可以獲得一些附加值較高的發(fā)酵產(chǎn)物。Eugenio實現(xiàn)了以甲醇為碳源，利用工程Pichia pastoris合成乙肝病毒表面抗原。Pichia pastoris在Pichia pastoris體內(nèi)過表達編碼蜱蟲蛋白的基因后，可以利用甲醇合成蜱蟲疫苗。Stuart等在Pichia pastoris細胞內(nèi)過表達水蛭素合成基因，發(fā)酵4天得到1.5g/L水蛭素。張元興等采用甲醇甘油混合流加的方法使重組畢赤酵母細胞干重達到162g/L，最終得到1.7g/L的水蛭素；還對發(fā)酵液的脫色和水蛭素的分離進行了探討。一些科研工作者開展了甲醇單細胞蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)利用甲醇作原料，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的單細胞蛋白含有豐富的氨基酸，可以作為安全的飼料添加劑。已有的關于甲醇生物利用的研究，主要通過甲基營養(yǎng)型菌株的簡單培養(yǎng)來驗證少數(shù)幾種產(chǎn)品的生產(chǎn)。總的來說，研究基礎比較薄弱，存在諸多亟待解決的問題。

異戊二烯是戰(zhàn)略資源性化工原料，供需不平衡。異戊二烯產(chǎn)量的95％用于合成橡膠，此外，也可應用于高品質(zhì)航空燃料等領域。目前制作輪胎的主要原料是天然橡膠和合成橡膠(聚異戊橡膠)。聚異戊橡膠因其分子結(jié)構及物化性質(zhì)與天然橡膠相近，是替代天然橡膠制造橡膠輪胎的理想原料。隨著我國汽車行業(yè)的快速發(fā)展，以及我國天然橡膠原料日益短缺，對異戊二烯的需求量不斷增加，預計2010年國內(nèi)異戊二烯需求量將達10.54萬噸，2013年增長到31.04萬噸，年增速46％左右，然而，我國異戊二烯產(chǎn)量不足，需要大量進口，價格不斷攀升，成為制約我國相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展和戰(zhàn)略安全的重要原料。