[發明專利]一株生產戊二胺的基因工程菌及其制備戊二胺的方法

有效

• 申請號: 201510767145.9
• 申請日: 2015-11-11
• 公開（公告）號: CN105368766B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 田康明;路福平;王正祥
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明提供一種戊二胺生產菌株及其高效生產戊二胺的工藝。所述菌株在賴氨酸脫羧酶啟動子ldcCp被替換為環境/營養因素控制型啟動子的同時表達信號肽，其催化合成戊二胺的酶的活力得到極大提高并可通過環境溫度進行調節，最終表達的酶介于細胞內膜與細胞壁之間，而不釋放的發酵體系中，可達到戊二胺高效轉化的目的和效果。實現在25～50℃的條件下，分別經過發酵培養菌體，變溫高效產酶和目標產物快速轉化三個階段，產戊二胺水平達到106?116.8g/L，賴氨酸轉化率達到了理論轉化率的91％～97％。

技術領域：

本發明屬于微生物技術領域，特別涉及一株能高效生產戊二胺的基因工程菌及其應用。

背景技術：

1,5-戊二胺，又名尸胺(cadaverine)、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素，是脂肪族生物胺類(包括精胺、腐胺、亞精胺和戊二胺等)中的一種。1885年，德國柏林的醫師Ludwig Brieger在腐敗的尸體中首次發現該胺類，并以此得名尸胺。在細胞內，戊二胺是賴氨酸合成途徑的延伸反應，是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脫羧產生的(如附圖1)，作為一種肉毒胺存在于腐敗物中，與鳥氨酸的脫羧產物腐胺一樣都是生物尸體腐敗產生的氣味中的一種成分。這種二胺不僅與腐敗作用有關，生物活體在生命代謝中也會產生少量的戊二胺，是生物體內廣泛存在的具有生物活性的含氮堿。

戊二胺具有許多重要的生理功能，如戊二胺是微生物細胞內調節鐵離子濃度的“鐵親和系統”和一些嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌肽聚糖的主要組成成分；戊二胺在關閉微孔蛋白通道和保護大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用；內源性戊二胺的分泌以及胞內高濃度戊二胺積累可導致外膜滲透性降低，抑制某些抗生素如頭孢霉素類抗生素的作用。

戊二胺在農業、醫學和工業上均具有廣泛的應用。在農業上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促進果實發育，提高果實的產量；在醫學上，它也可作為一種有效治療痢疾的藥物；在工業上，戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優質高分子材料。

微生物法生產戊二胺，是一條新穎且具有潛在競爭力的生產途徑，而現有技術更多的關注在賴氨酸脫羧酶的表達和重組菌的構建等。

如：由日本的東麗株式會社申請的專利號為公開號為CN 102844440 A的中國專利《1,5-戊二胺的制造方法》公開了一種利用微生物發酵的1,5-戊二胺的制造方法，所使用的微生物是染色體中具有LDC基因的棒狀桿菌，可使棒狀桿菌在培養過程中持續保持20mU/mg蛋白以上的賴氨酸脫羧酶活性。

德國的巴斯夫歐洲公司申請的公開號為CN 101389765 A的專利《生產尸胺的方法》公開了一種通過構建重組微生物并培養所述微生物來生產尸胺的方法

德國的贏創德固賽有限責任公司申請的公開號為CN 101240258A的專利則公布了戊二胺制備相關專利關注的是發酵條件優化和重組菌構建過程的保護。

可見，現有技術并沒有在如何更高效的制備用于戊二胺合成的催化細胞方面進行技術創新性研究。本發明則通過建立戊二胺合成所需催化細胞及其高效制備方法，從而實現戊二胺的大規模制備過程。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明提供一種可高效生產戊二胺的基因工程菌以及利用其制備戊二胺的高效制備工藝。

本發明所提供的技術方案之一是，提供一種可高效生產戊二胺的基因工程菌，所述基因工程菌其賴氨酸脫羧酶啟動子ldcCp被替換為環境/營養因素控制型啟動子，使得生產菌株在生長過程中不大量合成目標酶，即目標酶的痕量合成不影響細胞生長，而在生長完成后通過改變環境/營養因素快速過量表達目標酶及其輔因子。

進一步的，所述基因工程菌其出發菌株，可以為大腸桿菌K12、DH5α、W3110、BL21、MG1655等；

更進一步的，所述出發菌株為大腸桿菌B0013-070；