[發明專利]一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體

有效

• 申請號: 201510766758.0
• 申請日: 2015-11-11
• 公開（公告）號: CN105274080B
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 陳堅;劉松;阮潔;馮岳;李江華;陳雙全;邱芳芳;王晨蕾
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領域，所述突變體是對肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸進行突變。所述肌酸水解酶來源于大腸桿菌。所述突變體是將第368位的纈氨酸突變為蛋氨酸，得到突變體V368M。所述突變是對來源于大腸桿菌的肌酸水解酶蛋白質內部氨基酸進行定點突變，從而提高了肌酸酶的熱穩定性。相對于現有的突變體V368M的半衰期提高了5倍，其Tm值提高了3℃。

技術領域

本發明公開了一種熱穩定性提高的肌酸水解酶(Creatinase，EC 3.5.3.3，簡稱CRE)突變體,屬于酶工程領域。

背景技術

肌酸水解酶是酶促檢測法中檢測肌酐的一種必不可少的酶，主要來源與微生物。在一些研究中發現一些屬的菌株能夠通過誘導產生肌酸水解酶并在細胞中積累。這些細菌有假單胞菌屬、梭菌、黃桿菌屬、芽孢菌屬、產堿菌屬等等。但由于原始菌的肌酸水解酶產量很低，且誘導劑的價格較高，不適合進行工業化大規模生產。同時，對肌酸水解酶的性質分析發現其具有底物親和力低，熱穩定性差等特點。在實際應用中就需要有大量的酶，不利于工業生產。

目前對肌酸水解酶性質分析比較深入的菌株主要是惡臭假單胞菌、節桿菌和產堿桿菌。綜合分析不同來源的肌酸水解酶學性質，多數肌酸水解酶的最適反應pH范圍為7.0～8.0，在中性、弱堿和弱酸條件下保持穩定。已報道的肌酸水解酶的最適反應溫30～40℃，而熱穩定性不是很理想，在45℃以下相對穩定，溫度一旦高于45℃，酶活會迅速下降。因此，對肌酸水解酶的熱穩定性研究很有必要。本發明通過定點突變的方式將肌酸酶分子內部疏水性的氨基酸纈氨酸突變成疏水性強的蛋氨酸，改變了分子內部疏水性,顯著提高菌株的熱穩定性，更適合工業應用。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種熱穩定性提高的肌酸水解酶突變體。

所述突變體是對肌酸水解酶氨基酸序列的第368位氨基酸進行突變。

所述肌酸水解酶氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述肌酸水解酶核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述肌酸水解酶來源于大腸桿菌。

所述突變體是將第368位的纈氨酸突變為蛋氨酸，得到突變體V368M。

本發明還提供一種表達所述突變體的基因工程菌。

所述基于工程菌為大腸桿菌。

所述肌酸水解酶在測定人體肌酐含量、評價人體腎臟功能中的應用。

所述突變是對來源于大腸桿菌的肌酸水解酶蛋白質內部氨基酸進行定點突變，從而提高了肌酸酶的熱穩定性。

有益效果：

相對于現有的突變體V368M的半衰期提高了5倍，其Tm值提高了3℃。

說明書附圖

圖1：溫度對CRE活性和穩定性的影響

圖2：突變體Tm值測定。

具體實施方式

LB培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。

TB培養基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH₂PO₄ 2.32g/L、K₂HPO₄16.43g/L。