[發(fā)明專利]一種H7N9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510745998.2
• 申請日: 2015-11-05
• 公開（公告）號: CN105603058A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 祁賢;章倩云;宋勇春;湯奮揚;王慎驕;余慧燕;鄧婓
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;G01N33/53
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分型檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的RT-PCR-ELISA試劑 盒及其使用方法。

背景技術(shù)

甲型流感病毒分類上屬于正粘病毒科，基因組由8個單鏈負(fù)義RNA節(jié)段組成。甲型流感病毒宿主較 廣，可以感染人、禽和其它哺乳動物。根據(jù)病毒表面2個糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原 性，甲型流感病毒可以分為不同的血清亞型。目前已在甲型流感病毒的自然儲存宿主野生水禽中發(fā)現(xiàn)16 種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。一般情況下，禽流感病毒不會突破種屬障礙感染人。 但自1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件以來，禽流感病毒(包括H5、H9和H7亞型)感染人事件 的發(fā)生越來越頻繁。2013年初，在我國長三角地區(qū)出現(xiàn)一種新的通過基因重配產(chǎn)生的H7N9亞型禽流感病 毒，該病毒能夠跨物種感染人并引起嚴(yán)重疾病。目前中國大陸的省份和地區(qū)都有病例報道，截止，對 人類健康和公共衛(wèi)生造成新的重大威脅。

目前針對H7N9亞型禽流感病毒感染的核酸檢測方法主要有基因測序法、Real-timetimePCR法和環(huán)等 溫擴(kuò)增(LAMP)法等。基因測序法是分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時費力，一般需要24-48小時，對實驗人 員的技術(shù)要求高，同時試驗儀器和試劑昂貴，一般實驗室難以開展。Real-timetimePCR法和LAMP法具 有很好的特異性和敏感性，但前者同樣依賴昂貴的儀器和試劑；而后者難以實現(xiàn)多重檢測。因此，建立一 種成本低、通量高、適合現(xiàn)場診斷的H7N9亞型核酸分子檢測方法，對于疾病的臨床救治和防控意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的問題是提供一種分型檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA試劑盒及 其使用方法。

本發(fā)明提供的檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA的試劑盒由RT-PCR反應(yīng)體系；3個 靶基因甲型流感病毒M基因、H7N9亞型病毒HA基因和H7N9亞型病毒N9基因的陽性質(zhì)粒：pMD-M、 Pmd-H7和Pmd-N9；陰性質(zhì)控品和3個靶基因的特異性引物探針(表1)組成，探針的5端用生物素(BIctO) 標(biāo)記。

表1靶基因的特異性引物探針

本發(fā)明所述一種多重PCR-ELISA試劑盒在H7N9亞型禽流感病毒分型檢測中的使用方法：

(1)病毒核酸提取：采用常規(guī)方法提取臨床鼻咽拭子標(biāo)本或病毒培養(yǎng)物核酸，-70℃冰箱放置備用。

(2)多重PRT-PCR反應(yīng)：采用TaKaRa公司的一步法試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：10× ExTaqBuffer4μL，25mMMgCl5μL，2.5mMdNTPs6μL，TaqDNA聚合酶5U，M、H7和N9上下游 引物各0.75μL，模板1.6μL，加DEPC水至50μL.。擴(kuò)增程序為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，94預(yù)變性2min， 熱循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后，72℃延伸7min，得到生物素標(biāo) 記的PCR產(chǎn)物，同時設(shè)置空白對照組。

(3)ELISA檢測:取擴(kuò)增好的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中， 于室溫下變性10min，再加入10nmol/L地高辛標(biāo)記的特異性探針(用含有300mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的雜交液稀釋)，50℃孵育10min。隨后，取100μL液體 加至鏈霉親和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，棄去孔中液體，加入300μLPBST洗板5次。然 后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB顯色液 進(jìn)行顯色，一定時間后加入終止液終止顯色，于酶標(biāo)儀450nm波長處測定其吸光度值(OD)。本實驗需設(shè) 置兩個或兩個以上重復(fù)，同時以PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的空白對照作為陰性對照組，若實驗組的OD值>2倍陰 性對照組平均OD值，則判定為陽性，反之則為陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：。