[發明專利]具核梭桿菌的恒溫檢測方法及其專用引物與試劑盒

有效

• 申請號: 201510744512.3
• 申請日: 2015-11-04
• 公開（公告）號: CN105256046B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 黃留玉;劉威;黃思妺;鄒大陽;董德榮;楊展;劉寧偉;楊文超;賀曉明;敖大;徐雅晴;唐玥;馬文;秦日輝
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了具核梭桿菌的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發明提供了用于檢測具核梭桿菌的環介導等溫擴增引物，其由引物1、引物2、引物3、引物4和引物5組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的核苷酸序列分別為序列表中的序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到具核梭桿菌，不需要復雜儀器，為具核梭桿菌的檢測提供了新的技術平臺，可用于基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測具核梭桿菌，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及細菌的分子生物學檢測方法，特別是涉及具核梭桿菌的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。

背景技術

具核梭桿菌(F.nucleatum)屬于革蘭陰性專性厭氧菌，參與牙周疾病的炎癥反應，常在齦下菌斑中分離到，是在牙周病中起主導作用的微生物，也是成人牙周炎和青少年牙周炎的可疑致病菌之一。該菌除可引起口腔疾病外，還可引起身體其他部位的感染，包括腦、肺和肝，血液和關節，胸和腹部。具核梭桿菌還是一種常見的宮內感染厭氧菌，可在早產且留有完整胎膜的孕婦羊水中檢測出，提示其可能在早產發病機制中起了重要的作用。具核梭桿菌作為主要的厭氧微生物在齦下菌斑中聚居，其存在與繁殖引起了牙周組織中局部炎癥的發生。

2011年10月，來自加拿大BC癌癥研究所和Broad研究所的兩個研究小組，證實這種細菌也存在于腸道中，且其在腸道中的豐度與結直腸癌相關?，F在，兩項新研究提供了功能證據，可幫助解釋具核梭桿菌是如何推動癌癥形成的。

在發表于2013年8月13日《Cell Host&Microbe》雜志上的兩篇論文中，分別由哈佛醫學院Aleksandar Kostic和凱斯西儲大學Mara Roxana Rubinstein領導的研究小組利用腸腫瘤形成小鼠模型和人類結腸癌細胞，證實具核梭桿菌誘導了促炎癥反應和致癌活動，促進了結直腸癌生長。

環介導的等溫核酸擴增技術(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H,MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic AcidsRes 2000；28(12):63.)發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴4條特異設計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Masaki Imai等人(Imai M,Ninomiya A,Minekawa H,et al.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediatedisothermal amplification method.J Virol Methods.2007；141(2):173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N,Arai R,TadaS,Taguchi H,Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkerasp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.FoodMicrobiol.2007；24(7-8):778-85.)針對四種香酒酵母的ITS序列設計了LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測其它與人類相關的病毒，如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黃化曲葉病毒等。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測具核梭桿菌的LAMP專用引物與試劑盒問世。

發明內容