[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510744205.5
• 申請日: 2015-11-03
• 公開（公告）號: CN105274049A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛堅(jiān);鐘秀風(fēng);李康寯
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種誘導(dǎo)人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞，以該單細(xì)胞作為種子細(xì)胞接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，種子細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有神經(jīng)營養(yǎng)因子和維持濃度的視網(wǎng)膜分化營養(yǎng)液組成的培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必須氨基酸1ng、肝素2μg，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基，所述的DMEM/F12培養(yǎng)基是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按照體積比1：1混合而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)是在37℃、5％C02，飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層消化為單細(xì)胞是將人iPSc源性的3D視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層放入D-Hanks液中，分離組織，離棄視網(wǎng)膜組織中色素沉著部分，保留金黃色的組織部分的神經(jīng)纖維層，將分離的神經(jīng)纖維層組織用PBS沖洗，吸除PBS后用accutase細(xì)胞消化液消化細(xì)胞團(tuán)成單細(xì)胞后加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基終止消化，混懸液離心去上清后，得到種子細(xì)胞。