[發明專利]一種蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體制備方法及應用

有效

• 申請號: 201510740094.0
• 申請日: 2015-11-03
• 公開（公告）號: CN105237634B
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;朱龍佼;黃昆侖;邵向麗;解沛燕;徐瑗聰;翟百強
• 申請（專利權）人: 北京福德安科技有限公司;中國農業大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)固定：使用一定濃度的多聚甲醛在合適的溫度下孵育處理，使得蠟樣芽孢桿菌的表面成分固定，得到的菌抗原的抗原決定簇與活菌的狀態一致，然后離心洗滌，得到菌抗原；

(2)免乳化：將固定好的蠟樣芽孢桿菌用生理鹽水懸浮調至合適菌濃度，準備動物免疫；

(3)短間隔脈沖免疫：選擇六個外周免疫位點以肌肉注射方式，在短間隔脈沖免疫期內，將制備得到的細菌抗原懸浮液注射到BALB/c小鼠體內；六個外周免疫位點為腹股溝、腋窩、腳蹼的兩側對稱位點，短間隔脈沖免疫是指在第1,3,6,8,10和13天時以肌肉注射的方式，注射濃度為10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴cells/mL無免疫佐劑輔助的菌抗原懸浮液；

(4)實體瘤種植：取6～8周齡的免疫缺陷型小鼠BALB/c，制備SP2/0骨髓瘤RPMI1640懸浮液，懸浮液的細胞濃度調整為1～10×10⁷cells/mL，以皮下注射方式注射到小鼠頸部，8～10天后觀察出現明顯凸起，并有拇指大硬塊即為實體瘤；

(5)細胞融合：融合用骨髓瘤細胞懸浮液是將實體瘤取出利用組織研磨器及細胞篩制備得到；選血清滴度高的小鼠供脾臟及淋巴結，制備脾臟及淋巴細胞混合懸浮液，與一定比例的骨髓瘤細胞懸浮液混勻離心，扣干，在一定時間范圍內加入一定濃度的化學誘導融合劑，在一定溫度范圍內靜置孵育一定時間，加入不完全培養基終止反應；

(6)半流體選擇性培養：向含有選擇性成分HAT的完全培養基添加一定質量的增稠劑使得培養基成為半流體狀，將融合細胞均勻分散在半流體培養基，于二氧化碳細胞培養箱培養；

(7)消減篩選：將獲得雜交瘤細胞上清，首先進行一定輪數的陽性篩選，然后進行相應輪數的陰性篩選，陰性篩選選取蠟樣芽孢桿菌相似菌作為篩選抗原，蠟樣芽孢桿菌的相似菌為蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，產氣莢膜桿菌，得到的雜交瘤細胞即為所取。

2.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟(1)中，蠟樣芽孢桿菌固定方法是用3～5％的多聚甲醛在20～30℃溫度下孵育15～25min，離心條件為8,000～12,000rpm離心20～30min，洗滌三次后離心得菌抗原沉淀。

3.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟(2)中，將步驟(1)制備的菌沉淀用滅菌生理鹽水重懸制備菌懸浮液，用彼得羅夫·霍澤(petrofhausser)細菌計數板調整為10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴cells/mL準備動物免疫。

4.根據權利要求1所述的一種蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟(5)中，所述脾臟及淋巴細胞混合懸浮液是用血清效價最高的小鼠腸系淋巴結、腹股溝淋巴結及脾臟經組織研磨器研磨及過篩處理制備完成，所述骨髓瘤細胞懸浮液與所述脾臟及淋巴細胞混合懸浮液的混合比例是5～10：1，混合容器是40～60mL離心管，離心轉數是1500～1800rpm，離心時間為7～10min，融合溫度為35～40℃，化學誘導融合劑為30～50％PEG1450，加誘導融合劑的時間范圍是80～100s，靜置孵育時間為0.5～1.5min，不完全培養基為RPMI1640。