[發(fā)明專利]揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的Ⅱ類MHC基因的特異性引物及分型方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510738232.1
• 申請日: 2015-11-03
• 公開（公告）號: CN105316409A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方盛國;萬秋紅;翟騰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

1.一對用于揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的Ⅱ類MHC基因的單位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物，引物的名稱及具體序列下：

上游引物：Beta1085E2F：CTCTGCCCAGTAGGAGCCGTGC；

下游引物：Beta1085E2R：AACAAAGACCCCAGGAATCCAG。

2.一種揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的Ⅱ類MHC基因的分型方法，其特征在于采用權(quán)利要求1所述PCR引物對，進(jìn)行PCR反應(yīng)，每對引物均在10μLPCR體系中進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物分別利用SSCP進(jìn)行基因分型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的10μLPCR體系為：揚(yáng)子鱷個(gè)體基因組DNA0.8μL，上下游引物各0.2μL，超純水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、銀染后以及顯色后應(yīng)分別使用雙蒸水洗膠4次，以獲得清晰的SSCP條帶。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型的方法是：

1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；

2)制備12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；

3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用裝滿0.5×TBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0.5×TBE，預(yù)電泳20min；

4)樣品電泳，吸取7uLPCR產(chǎn)物，加入4uL2×loadingbuffer，快速離心混合，95℃變性4min30s后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4℃，35W，電泳6-7h；

5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；

6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速洗膠4次；

7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；

8)讀取條帶，確定基因型。