[發(fā)明專利]一種人工合成的BT抗蟲基因FLAc及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510736628.2
• 申請日: 2015-11-04
• 公開（公告）號: CN105331620A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝東云;韓四平;尹悅佳;李楠;賀紅霞;劉相國;劉洋;柳青;閆瑋玉;王陽
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C07K14/325;C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人工合成的BT抗蟲基因FLAc及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽性菌。早在1901年從染病的家蠶體液中分離出一種對部分鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲具有毒殺作用的細菌，即Bt。研究發(fā)現(xiàn)Bt在芽孢形成過程中，菌體的一端或兩端會形成一個或多個具有生物活性的蛋白質(zhì)伴胞晶體，能在一些昆蟲體內(nèi)活化成有毒性的蛋白，并與昆蟲中腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，使其產(chǎn)生穿孔，從而殺滅昆蟲。

Bt的殺蟲活性與伴胞晶體(parasporalcrystal)有關(guān)，人們稱這種蛋白質(zhì)為δ-內(nèi)毒素(δ-endotoxins)或殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，而將編碼這種蛋白的基因統(tǒng)稱為Bt基因。目前已經(jīng)從不同Bt的亞種中分離出400多種Bt基因，它們編碼的殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性。由于該蛋白還具有對人畜無害，不污染環(huán)境等優(yōu)點，Bt基因已成為目前世界上應(yīng)用最為廣泛的抗蟲基因。

將具有溶胞作用的殺蟲晶體蛋白歸到Cyt類，其余歸為Cry類，相應(yīng)的基因記為Cyt和Cry。本專利中涉及的FLAc基因編碼的殺蟲晶體蛋白為Cry類。殺蟲晶體蛋白是根據(jù)氨基酸同源性進行分類的。同源性在45％以下，為第一等級，用阿拉伯數(shù)字表示；同源性在45％～78％之間，為第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78％～95％之間，為第三等級，用小寫英文字母表示；同源性在95％以上，為第四等級，用阿拉伯數(shù)字表示。例如Cry1Ab2。

對已經(jīng)獲得的Cry蛋白家族X-ray結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，Cry蛋白家族的三維結(jié)構(gòu)典型特征是含有明顯能區(qū)分出來的三個Domain，即DomainⅠ、DomainⅡ、DomainⅢ。DomainⅠ由7個α螺旋組成，是殺蟲蛋白發(fā)揮功能的主要區(qū)域，參與了殺蟲蛋白低聚物形成和插入細胞膜形成穿孔導(dǎo)致細胞死亡的過程，其中第1、3、4和5個α螺旋在發(fā)揮功能起到最關(guān)鍵作用。已有的研究表明：第1個α螺旋是啟動殺蟲活性的部位，當?shù)?個α螺旋被切除后，殺蟲蛋白低聚物開始形成，并插入細胞膜導(dǎo)致跨細胞膜穿孔。第3個α螺旋是不同殺蟲蛋白亞基相互結(jié)合形成低聚物的區(qū)域。第4和5個α螺旋形成發(fā)卡(hairpin)結(jié)構(gòu)，是殺蟲作用的具體執(zhí)行區(qū)域，主要功能是殺蟲蛋白形成低聚物的結(jié)合點也是插入細胞膜形成跨膜穿孔的區(qū)域(Natalie,etal.,2001)。DomainⅡ由β折疊組成3個loop環(huán)，主要參與殺蟲蛋白與受體結(jié)合。DomainⅢ由β折疊組成輪狀拓補結(jié)構(gòu)，主要參與殺蟲蛋白與受體的識別，是不同BtCry蛋白識別不同害蟲的主要功能區(qū)域，DomainⅡ和DomainⅢ共同決定靶標害蟲的類型(Bravo,etal.,2007)。Cry蛋白家族成員之間雖然氨基酸序列不同，但是在三維結(jié)構(gòu)上相對保守，表明該家族所有成員具有相似的殺蟲機制(Cohen,etal.,2008)。