[發明專利]可再生輔酶NAD+的水型NADH氧化酶及其編碼基因與應用

在審

• 申請號: 201510730631.3
• 申請日: 2015-11-02
• 公開（公告）號: CN105331589A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 張建棟;范曉軍;崔智美;張照昱;武華磊
• 申請（專利權）人: 太原理工大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P7/26
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

技術領域

本發明屬于生物技術領域中的NADH氧化酶，具體是一種可再生輔酶NAD⁺的水型NADH氧化酶及其編碼基因與應用，該氧化酶能夠利用O₂作為底物將NADH氧化為NAD⁺，同時生成副產物H₂O。

背景技術

隨著氧化還原酶在生物催化制備手性醇、手性羥酮、羥基酸、氨基酸等方面顯示越來越重要的作用，在制藥，食品，精細化工，農藥等領域均表現出廣泛的用途，對該類型的酶的研究也成為當今研究的熱點之一。但是氧化還原酶在反應過程中，需要消耗一定量輔酶，大約80％的氧化還原酶的輔酶為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺/NADH)，使得這類輔酶在工業和科研上的需求隨之劇增。然而，輔酶的價格是非常昂貴的，有時甚至比酶催化反應所得到的產物的價格還要高，而其重復利用性和穩定性卻很低。輔酶再生是實現氧化還原酶催化反應的必需步驟，是關系到氧化還原酶工業化應用的關鍵。而對于很多氧化還原酶的應用來講，輔酶再生面臨巨大的挑戰。

輔酶再生的方法主要有生物法、酶法、化學法、電化學法和光化學法。酶法原位再生輔酶由于操作簡單、效率高專一性強，而且可與其它酶兼容，受到人們的青睞。酶法再生輔酶的方法中，應用于還原性輔酶(NAD(P)H)的再生已經比較成熟，如甲酸脫氫酶再生NADH和葡萄糖脫氫酶再生NADPH。而氧化性輔酶(NAD(P)⁺)的再生方法卻很少，實現氧化性輔酶的再生，對于在生物催化過程中生產難以制備的酮類化合物或對應體純的醇類化合物是非常關鍵的。目前應用比較多的方法主要有：醇脫氫酶還原丙酮生成異丙醇再生輔酶NAD⁺；乳酸脫氫酶還原丙酮酸生成乳酸再生輔酶NAD⁺；谷氨酸脫氫酶還原α-酮戊二酸生成谷氨酸使NAD⁺再生。但是這些方法仍然還難以滿足工業化生產的需求，因為這些方法通常需要加入輔底物，并有輔產物生成，使下游提取過程更加困難，生產成本也大大增加，有時甚至會產生酶抑制現象影響反應效率。

最近幾年，通過NADH氧化酶再生輔酶逐漸得到了人們的重視，NADH氧化酶(NADHoxidase,NOX,EC1.6.99.3)是一種黃素蛋白，在O₂存在條件下，該酶催化NADH氧化為NAD⁺的同時O₂還原為H₂O或H₂O₂。根據O₂還原后產物的不同，NOX可分為兩類：一類還原為H₂O₂，反應過程產生2個電子的轉移，稱之為H₂O₂型NADH氧化酶；另一類還原為H₂O，反應過程中產生4個電子的轉移，稱之為H₂O型NADH氧化酶。H₂O₂型NADH氧化酶，由于產生的過氧化氫對氧化還原酶有失活作用，而且在應用過程中需要加入過氧化氫酶分解H₂O₂，這樣使得反應體系更加復雜，因此在應用上該型酶受到一定限制。鑒于以上原因，H₂O型NADH氧化酶的研究越來越受到人們的重視，因為它的產物為水，對反應體系基本沒有多大影響，操作簡單且容易分離，可用于再生NAD⁺，具有廣闊的應用前景，是非常有潛力的氧化態輔酶再生體系之一。目前，國外已有不少關于不同來源的NOX的研究報道，但是能應用于工業化生產的H₂O型NADH氧化酶還是比較少，所以挖掘開發更多新型高活性H₂O型NADH氧化酶是非常有必要的，目前國內專門針對該類型酶的研究還比較少。

發明內容

本發明旨在提供一種可再生輔酶NAD⁺的水型NADH氧化酶及其編碼基因與應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：可再生輔酶NAD⁺的水型NADH氧化酶，是如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

上述水型NADH氧化酶的制備步驟為：

S1：將如SEQIDNO.2所示的水型NADH氧化酶編碼基因插入到質粒中得到重組表達載體；

S2：將所述重組表達載體轉移到宿主微生物中得到基因工程菌；

S3：培養所述基因工程菌得到重組NADH氧化酶，即本發明所述水型NADH氧化酶。