[發明專利]睫狀神經營養因子突變體及其修飾型突變體和應用

有效

• 申請號: 201510729368.6
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN106632650B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 王健;鄭秀玉;柳森;張夕燕;李莉莉;蔡覓;李素貞;劉君
• 申請（專利權）人: 北京生物制品研究所有限責任公司;國藥中生生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K14/475
• 分類號: C07K14/475;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/18;A61P3/04
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

本發明涉及一種CNTF突變體及其修飾型突變體和應用。所述CNTF突變體是在天然CNTF的氨基酸序列的基礎上發生突變得到的，所述突變包括：第40位的賴氨酸突變為半胱氨酸，以及第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸。通過本發明的CNTF突變體能夠獲得修飾專一性高的修飾型CNTF，從而克服因修飾而帶來的修飾產物不均一、結果不穩定等問題，并使重組CNTF蛋白結構穩定，與天然蛋白相比具有更高的生物學活性和可溶性，并且修飾型CNTF與未修飾型CNTF相比具有長效作用。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體而言，涉及一種修飾型睫狀神經營養因子突變體、DNA、重組表達載體、遺傳工程宿主細胞、修飾型睫狀神經營養因子突變體、所述睫狀神經營養因子突變體以及修飾型睫狀神經營養因子突變體的應用、藥物組合物。

背景技術

睫狀神經營養因子(Ciliary neurotrophic factor,簡稱CNTF)因為最初是從雞的睫狀體中提取出來，并可維持雞副交感神經節的存活而得名。CNTF全長由200個氨基酸組成，第17位有Cys，無分子內二硫鍵，無糖基化位點。CNTF全長分子量在23KD左右。在體內以兩個二聚體形式進行儲存，經過酶解成單體后發生生物學作用。CNTF可以促進包括：運動神經元、感覺神經元、交感神經元、海馬神經元等多種神經細胞和神經膠質細胞的生長和分化。90年代，在將CNTF用于治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)的實驗研究中發現，對一組ALS患者進行臨床研究發現病人的體重大大降低，使用藥物組體重比安慰劑組明顯降低。而且這一結果持續整個研究過程。針對這一結果在肥胖癥領域進行實驗，結果表明CNTF在體內可與下丘腦的特異性受體結合，激活抑制食欲的關鍵信號通路，抑制進食欲望且使機體不會產生饑餓感，從而使體重減輕。研究發現，CNTF具有多種功能，能促使多種神經細胞的存活、營養肌肉、促進糖、脂代謝和調節能量平衡以及攝食行為。在神經系統，肌肉系統，肥胖癥極其相關疾病的治療中具有重要意義和廣闊的臨床前景。

CNTF是本領域技術人員所熟知的，通常使用CNTF突變體解決CNTF的生物活性不高以及表達量低的問題。因此，目前現有技術中已開發出了多種CNTF的突變體(或稱變異體)，多種重組人睫狀神經營養因子是市售的。CNTF突變體或變異體的制備方法在現有技術中也是已知的，例如中國專利CN1687413A公開了一種CNTF突變體(hCNTF)，第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸；第63位的谷氨酰胺突變為精氨酸；第64位的組氨酸突變為丙氨酸；并去除了C末端1-30個氨基酸。CN1760205A公開了一種CNTF突變體(hCNTF)，第17位半胱氨酸突變為絲氨酸，并去除了C端的16個氨基酸；而且第53位的丙氨酸突變為纈氨酸，第35位的蘇氨酸突變為蛋氨酸，第178位的苯丙氨酸突變為纈氨酸。CN1844392也公開了睫狀神經營養因子的突變體。

但上述CNTF的突變體或變異體仍存在體內的作用時間短，要求反復多次給藥；免疫原性強副反應嚴重，給病人帶來巨大的經濟壓力和精神壓力的缺點。因此，目前選擇使用PEG修飾后的蛋白，其有以下優勢：分子量增大、半衰期延長、免疫原性降低。PEG擁有獨特的親-疏水平衡：當偶聯到藥物分子表面時，將其優良性質賦予修飾后的藥物，改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產生空間屏障，減少藥物的酶解。覆蓋蛋白表面的抗原決定簇，降低蛋白的免疫原性。這樣，可以增加蛋白的分子量和體積，減少腎小球的濾過作用，使蛋白在體內作用時間更長。聚乙二醇(PEG)于1940年首次商業生產化。PEG的使用通過了美國FDA認證，符合美國藥典(USP)、國家處方集(NF)、食品化學法典(FCC)標準，被廣泛應用于食品、飼料、個人護理品、化學、醫藥化工等生產生活領域。