[發明專利]一種固定化金屬離子親和色譜材料及其制備和應用

有效

• 申請號: 201510725879.0
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN106622181B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 張麗華;李森武;楊開廣;趙寶鋒;李瀟;劉路寬;陳遠波;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01J20/30;B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種新型固定化金屬離子親和色譜材料(IMAC)及其制備和應用。所述的新型IMAC材料在傳統IMAC材料表面進行涂層改性，通過表面涂層孔隙篩分作用的選擇性，使蛋白質裸露的末端進入涂層進而被金屬離子捕獲，而其他完整蛋白質傳質阻力較大，很難進入涂層。該材料結合了IMAC材料的強親和力及表面涂層孔隙篩分作用的高選擇性，并進一步用于生物分析、生物化工、生物技術領域中組氨酸標簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化中。

技術領域

本發明屬于功能性生物材料及其制備和在蛋白質特異性捕獲、釋放及純化中的應用，具體的說是一種新型的表面涂層改性的固定化金屬離子親和色譜材料制備及其作為親和純化材料用于組氨酸標簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

背景技術

重組蛋白技術在蛋白質結晶、蛋白質藥物、蛋白質相互作用及結構蛋白質組學研究中具有非常重要的作用(T.Hyeon,et al.Adv.Mater.,2010,22,57–60；A.S.Robinson,etal.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。從蛋白質結構功能的研究到功能性蛋白質表達與純化工藝的開發，親和標簽已經成為重組蛋白純化中的一個非常重要且有效的工具。由于組氨酸標簽具有標簽短小、低免疫原性、不影響蛋白構象及功能、表達暴露于蛋白表面、親和力強、易于純化等優點，是目前重組蛋白純化中使用最廣泛親和標簽(A.S.Robinson,etal.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。

對組氨酸標簽蛋白的純化，目前常采用固定化金屬離子親和色譜(IMAC)技術，即通過IMAC材料上的金屬離子與組氨酸標簽之間的螯合作用實現組氨酸標簽蛋白的捕獲，隨后利用競爭性螯合試劑或低pH洗脫液洗脫，使組氨酸標簽蛋白特異性洗脫，實現其純化。然而，由于IMAC材料上金屬離子暴露在材料表面，任何能與金屬離子產生螯合作用的蛋白質均被捕獲在IMAC上，如表面富含組氨酸、半胱氨酸、賴氨酸的蛋白質。同時，含有金屬離子的蛋白質也可被IMAC捕獲(A.S.Robinson,et al.Biotechnol.J.,2012,7,620–634)。這些蛋白質的吸附會導致組氨酸標簽純化純度大幅降低，為達到所需純度必須進行后期的二次甚至三次純化(J.K.Shea,et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136,1194-1197)，純化步驟越多，純化效率越低，純化成本也會大幅增加。因此，開發一步法高純度純化組氨酸標簽蛋白的新型固定化金屬離子親和色譜材料意義重大。

對材料表面進行涂層改性，可以利用所包覆涂層的特性對基質材料的吸附行為進行調節。通過在IMAC材料表面包覆聚合物涂層，能在IMAC材料的金屬螯合位點周圍形成聚合物網絡，利用聚合物網絡的孔隙篩分作用，能使小分子、肽段及裸露在外的自由度較高的蛋白質末端進入聚合物網絡進而被IMAC上金屬離子所捕獲；而由于空間位阻作用，其他體積較大的大分子蛋白質很難進入位點。通過這種表面涂層的孔隙篩分作用，IMAC材料能實現對特定目標物的特異性捕獲及純化。

因此，我們以IMAC材料作為基質材料，通過自由基聚合反應在IMAC基質材料表面包被了一層聚合物涂層。在聚合物網絡的篩分作用下，組氨酸標簽蛋白的末端裸露組氨酸標簽可以進入聚合物網絡被IMAC材料捕獲，而其他蛋白質缺乏末端組氨酸標簽，同時完整蛋白空間阻力太大，無法進入聚合物網絡。最終，利用表面涂層改性的IMAC材料實現了組氨酸標簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化。

發明內容

選擇表面固載了金屬離子的基質材料，通過功能單體聚合形成表面包被的聚合物涂層，制備得到表面涂層改性的IMAC材料，并且將該材料用于組氨酸標簽蛋白的特異性捕獲、釋放及純化中。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

(1)在基質材料表面通過化學修飾引入功能單體聚合反應的反應位點，如氨基、巰基、羧基、碳碳雙鍵、環氧基團等。