[發明專利]一種檢測親水支架上細胞培養狀態的方法

有效

• 申請號: 201510725158.X
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105274184B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 敖英芳;孟慶陽;黃洪杰;皮彥斌;袁蘭
• 申請（專利權）人: 北京大學第三醫院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 江崇玉

1.一種檢測親水支架上細胞培養狀態的方法，包括：步驟a、以2倍于親水支架體積的磷酸緩沖鹽溶液浸泡所述親水支架過夜，再用磷酸緩沖鹽溶液清洗所述親水支架2～3次；

將待檢測細胞接種到所述親水支架上進行培養，接種密度為1.8×10⁵-2.2×10⁵個細胞/毫升，至所述待檢測細胞在所述親水支架上的生長融合率為90％-95％時，獲得支架-細胞復合體系；

所述親水支架為魔芋葡甘聚糖微球支架；

所述待檢測細胞為SD大鼠骨髓間充質干細胞；

所述支架-細胞復合體系為魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系；

步驟b、采用吖啶橙染色液對所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系進行熒光染色，所述吖啶橙染色液為濃度為0.8-1.2mg/ml的吖啶橙乙醇溶液，包括：

用1ml微量移液器將所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系移入激光掃描共聚焦顯微鏡專用培養皿內，棄去上層清液，并用磷酸緩沖鹽溶液反復清洗3次，然后用1ml磷酸緩沖鹽溶液使所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系懸浮，形成魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系懸浮液；

每1ml所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系懸浮液中加入1ul所述吖啶橙染色液，然后孵育10分鐘，棄去上層清液；

再次用磷酸緩沖鹽溶液清洗三次后，用1ml無血清a-DMEM培養基重新懸浮魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系，得到用吖啶橙染色后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系；

步驟c、將染色后的所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，并利用綠色熒光通道和橙色熒光通道進行觀察，從而檢測得到所述魔芋葡甘聚糖微球支架上所述SD大鼠骨髓間充質干細胞的培養狀態；

所述綠色熒光通道使用的激發光的波長為515-545nm，所述橙色熒光通道使用的激發光的波長為590-620nm；

采用所述激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察的過程中，沿Z軸方向每隔0.8-1.2μm對所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系進行一次斷層掃描，待斷層掃描完成后，將全部斷層掃描圖像按Z軸方向上的順序疊加，獲得所述SD大鼠骨髓間充質干細胞在所述魔芋葡甘聚糖微球支架上三維狀態；

采用所述激光掃描共聚焦顯微鏡觀察洗滌后的魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系時，使所述魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓間充質干細胞復合體系懸浮在無血清的DMEM培養基中。