[發(fā)明專利]利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510720616.0
• 申請(qǐng)日: 2015-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN105255989A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳艷玲;張文;丁燕萍;程行健;申立文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州慶正鴻科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中;沈淵琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法。

背景技術(shù)

γδT細(xì)胞是一類近年來才被發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群，約占正常人外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)的1%～10%，人γδT細(xì)胞有兩個(gè)主要的亞群，即Vδ1T和Vδ2T細(xì)胞。Vδ1T細(xì)胞主要分布在人上皮組織中，Vδ2T細(xì)胞主要分布在人外周血中。Vγ9Vδ2T細(xì)胞占外周血γδT細(xì)胞的90%以上。隨著對(duì)γδT細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞除可直接識(shí)別蛋白質(zhì)和肽類抗原以及非肽類抗原而不需要MHC分子提呈，并且具有抗原提呈細(xì)胞的一些特征，此外還能通過細(xì)胞接觸和分泌的細(xì)胞因子起免疫調(diào)節(jié)作用。

γδT細(xì)胞在機(jī)體腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示腫瘤患者外周血中Vγ9Vδ2T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量及其產(chǎn)生INF-γ、TNF-α的能力與健康者相比均明顯下降。另一項(xiàng)研究表明，將可以刺激Vγ9Vδ2T增殖的白介素-2（IL-2）和氨基雙磷酸鹽化合物注射到轉(zhuǎn)移瘤患者體內(nèi)后，患者腫瘤體積明顯減小。因此，γδT細(xì)胞過繼免疫治療有著良好的前景。

在臨床應(yīng)用中，使用免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫過繼治療腫瘤前應(yīng)對(duì)其細(xì)胞毒效應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)或評(píng)價(jià)。目前常用的評(píng)價(jià)γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)的方法有MTT法、LDH法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等，但這些方法由于不進(jìn)行實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)控，因此細(xì)胞狀態(tài)的不同，操作手法的差異均可能造成誤差，從而引發(fā)對(duì)結(jié)果的誤判。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法的技術(shù)方案。

所述的利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）E-plate檢測(cè)板中每孔加入等體積培養(yǎng)液，將E-plate檢測(cè)板至于37℃條件下孵育0.5-1小時(shí)后，測(cè)定其背景阻抗值；

2）取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞接種于E-plate孔板中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；

3）待腫瘤細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，根據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)控所得參數(shù)，挑選細(xì)胞生長(zhǎng)狀況一致的板孔按不同的效靶比加入γδT細(xì)胞；

4）繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，待空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡期后終止實(shí)驗(yàn)；

5）利用系統(tǒng)自帶軟件分析γδT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。

所述的利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法，其特征在于所述的步驟1）中每孔加入培養(yǎng)液體積為50-150μl。

所述的利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法，其特征在于所述的步驟2）中每孔加入腫瘤細(xì)胞懸液50-150μl，其中包含細(xì)胞數(shù)量為4000-12000。

所述的利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法，其特征在于所述的步驟2）實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間為18-48小時(shí)。

所述的利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效果的方法，其特征在于所述的不同板孔中所加的γδT體積相同。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、可實(shí)時(shí)、無標(biāo)記、連續(xù)動(dòng)態(tài)地檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果的方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中不同效靶比γδT細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞的殺傷效果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例1

1）在37℃，5%CO₂環(huán)境中培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；

2）在E-plate檢測(cè)板中每孔加入95μl1640培養(yǎng)液，將E-plate檢測(cè)板至于在37℃條件下孵育0.5小時(shí)后，測(cè)定其背景阻抗值；

3）取適量對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞稀釋至50000cells/ml，每孔接種100μl細(xì)胞懸液，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；

4）24小時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)可判斷細(xì)胞是否進(jìn)入對(duì)數(shù)期，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，挑選細(xì)胞生長(zhǎng)狀況一致的板孔按不同的效靶比每孔加入5μl不同濃度的γδT細(xì)胞；

5）繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，待空白對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)入凋亡期后終止實(shí)驗(yàn)。

利用系統(tǒng)自帶軟件分析γδT對(duì)殺傷腫瘤細(xì)胞的殺傷效果（圖1，表1）。

表1.不同效靶比γδT細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

上述實(shí)施例中步驟2）中每孔加入培養(yǎng)液體積為50μl或150μl；步驟3）中每孔加入腫瘤細(xì)胞懸液50μl或150μl，其中包含細(xì)胞數(shù)量為4000或12000，最后也能達(dá)到與實(shí)施例1相同的技術(shù)效果。