[發(fā)明專利]一種增強玉米外源基因表達的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510719363.5
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN105331630A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康定明;劉永健;賀舒雅;郭二艷;葉凌風(fēng);劉琳;曹金伶;王映皓;張少蔓
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程，具體地說，涉及一種增強玉米外源基因表達的方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用，既需要研究開發(fā)出高效、易操作和低成本的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，也要求使已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因受體生物染色體上的外源轉(zhuǎn)基因能夠高水平的穩(wěn)定表達，以在受體生物上實習(xí)外源基因的功能，但是，外源轉(zhuǎn)基因進入受體后常常發(fā)生表達量降低，甚至轉(zhuǎn)基因沉默等現(xiàn)象，并沒有達到預(yù)期表達水平。據(jù)報道，外源基因插入受體染色的位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)錄中基因沉默和轉(zhuǎn)錄后的基因沉默等影響了外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達效率(李宏，2004)。目前，提高外源基因表達主要采用選擇強的啟動子和誘導(dǎo)型啟動子；選擇強的終止子；使用增強子等方法；也可以選擇適宜的轉(zhuǎn)化方法；或者用葉綠體作為轉(zhuǎn)化受體；篩選單拷貝后代植株；使用信號肽；使用病毒編碼蛋白；外源基因的修飾與改造；消除DNA甲基化的影響；使用受體生物偏愛的密碼子；包括使用核質(zhì)結(jié)合區(qū)序列(MAR序列)等(StiefAetal，1989)。而研究證實，將MAR與外源基因作為共同單元，構(gòu)建表達載體可以不受物種限制，并具有操作簡單效率高的特點，可以使外源基因在當(dāng)代穩(wěn)定表達而且促進外源基因在后代的穩(wěn)定遺傳(Migueletal，2007)，贏得重視。

MAR序列是染色質(zhì)上的一段與核基質(zhì)結(jié)合的DNA序列，分布間隔為5-200kb，MAR的長度一般為300-1000bp，少數(shù)可達幾個Kb。常含一些特征基序，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、酵母自主復(fù)制序列ARS、拓撲異構(gòu)酶II識別位點和能形成蛋白質(zhì)識別位點的松散DNA、彎曲DNA，富含AT區(qū)等。除了上述的一般特征外，不同的MARs還具有其特殊的結(jié)構(gòu)序列或特征。一些基因兩側(cè)的MAR有著不同的屬性，玉米adhI基因附近區(qū)域的MAR與核基質(zhì)結(jié)合時能形成7-70kb的染色質(zhì)環(huán)，在這個染色質(zhì)區(qū)域adhI基因5’端的MAR對核酸酶的酶解尤其敏感，而它對adhI基因的表達調(diào)控又是必需的。西紅柿hsc80基因的5’-MAR與3’-MAR有著截然不同的結(jié)合屬性。β-菜豆蛋白基因5’-MAR與3’-MAR有著截然不同的調(diào)節(jié)屬性(劉峰等，2003)。

MAR通過與核基質(zhì)結(jié)合使外源基因形成Loop環(huán)，而MAR處于Loop環(huán)的邊界處，每一個Loop環(huán)形成一個拓撲上獨立的區(qū)域，環(huán)的大小不影響其對外源基因的表達，染色體的凝結(jié)與DNA的轉(zhuǎn)錄在此區(qū)域不受干擾的獨立進行，從而造成一種分割作用，使每個轉(zhuǎn)錄單元保持相對的獨立性，從而使環(huán)內(nèi)基因免受周圍染色質(zhì)的影響(XuMYetal，2010)。Loop結(jié)構(gòu)模型暗示MAR序列可能作為一個邊界元件阻止染色體的凝縮區(qū)域或外源基因附近的調(diào)控元件對外源基因表達的影響，既可以使基因上游調(diào)控序列和基因啟動子相互靠近，又使環(huán)中的DNA序列靠近核基質(zhì)，便于基因的啟動子和增強子與RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，降低其受周圍染色質(zhì)狀態(tài)的影響，從而增強啟動子的活性，提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，減少基因沉默(Brouweretal，2002；Maximovaetal，2003)。

根據(jù)MAR序列在生物體內(nèi)功能的不同，可以簡單地把MAR序列分為3類：第一類位于基因的下游較遠處，此類MAR序列和核基質(zhì)的親和力比較高，在整個細胞周期中都保持與核基質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)，它們的作用是將染色質(zhì)分成許多大小不等的環(huán)，這些DNA環(huán)除了作為染色質(zhì)高級組織結(jié)構(gòu)的基本成分，同時也是基因表達調(diào)控單位。第二類MAR序列通常位于基因的啟動子區(qū)和上游調(diào)控序列的附近，與核基質(zhì)親和力較弱，只是在基因表達，啟動轉(zhuǎn)錄時才與核基質(zhì)暫時性地結(jié)合。第三類MAR和第二類MAR相同之處是它也只和核基質(zhì)暫時性地結(jié)合，不同之處是它們位于DNA復(fù)制起始區(qū)附近，和DNA復(fù)制起始點相鄰或在DNA復(fù)制起始點中，在DNA復(fù)制時便于復(fù)制叉的形成(Breyneetal，1994)。