[發明專利]一種用于誘導外周血單個核細胞產生結核特異性細胞因子的融合蛋白

有效

• 申請號: 201510697756.0
• 申請日: 2015-10-21
• 公開（公告）號: CN105218681B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 黃曦;馮思源;楊錕;田國寶;吳敏昊
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N33/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種用于誘導外周血單個核細胞產生結核特異性細胞因子的融合蛋白。本發明的融合蛋白包含CFP?10、ESAT?6和EspC三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。本發明提供的融合蛋白與現有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更強、特異性更高、刺激效果好。同時，本發明融合蛋白刺激PBMC產生大量結核桿菌抗原特異性的IFN?γ、IL?2、TNF?α等結核相關因子，且這一刺激誘導反應不受卡介苗的干擾。本發明將更有效的提高結核病的檢出率，對結核病的控制具有積極的意義。本發明的融合蛋白作為刺激物，可應用于結核病致病及免疫預防機制的研究，以及進一步的對結核病的控制中。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術中的蛋白領域，具體涉及一種用于誘導外周血單個核細胞產生結核特異性細胞因子的融合蛋白。

背景技術

結核病(tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌引起的一種傳染病，近年來隨著流動人口增加、人類免疫缺陷病毒(HIV)與結核桿菌伴發感染以及結核桿菌多重耐藥性菌株的出現，使全球結核病疫情增高，給全球結核病的防治提出了新的挑戰。全世界約有1/3的人口感染結核桿菌，每年新發結核病人約900萬，每年約有300萬人死于結核病，結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。中國是全球22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。

結核分枝桿菌是一種典型的胞內感染菌，機體對其免疫機制主要是以T細胞為主的細胞免疫。結核分枝桿菌通過呼吸道進入肺部，定植于肺泡巨噬細胞，逃逸宿主免疫防御機制；同時，原肺泡中未活化的樹突狀細胞（Dendritic cells, DC）抗菌活性弱，但可將結核分枝桿菌吞噬并遷移到其他組織，通過MHC將抗原提呈于T淋巴細胞導致其活化，活化的T淋巴細胞可產生多種細胞因子（INF-γ、IL-2與TNF-α等），這些細胞因子可激活其他免疫細胞，并共同作用于病灶中的結核分枝桿菌。根據這一免疫機制，通過對已感染結核分枝桿菌的患者及健康人血液中的細胞因子進行分析對比，發現感染結核分枝桿菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-α的濃度明顯升高。

使用體外誘導外周血單個核細胞（PBMC）產生結核相關細胞因子是目前診斷結核病的主要方式。外周血是人類免疫系統研究的主要對象，其中的PBMC包括淋巴細胞（T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞）、單核細胞和樹突狀細胞。將已經感染了結核分枝桿菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用結核相關抗原對其進行刺激，PMBC即可對抗原發生免疫反應，產生相應的細胞因子。由于直接使用結核分枝桿菌進行實驗具有相當的危險性，不利于進行大量研究，因此研究人員采用提取的結核分枝桿菌抗原蛋白進行研究實驗。

結核菌素純蛋白衍生物（PPD）是從結核分枝桿菌培養濾液中獲得的活性物質，其主要成分是蛋白質。PPD可以刺激T細胞產生IFN-γ、IL-2等細胞因子，但對于已經經過卡介苗（BCG）免疫個體的樣本，PPD同樣能夠刺激其提取出來的PBMC產生結核相關細胞因子，因此PPD的特異性較低，還需尋找特異性更好的刺激物。

發明內容

為了解決上述問題，尋找特異性更好的刺激物，本發明的目的在于提供一種用于誘導外周血單個核細胞產生結核特異性細胞因子的融合蛋白及其應用。

本發明所采取的技術方案是：

一種融合蛋白，包含CFP-10、ESAT-6和EspC三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。

優選的，連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS（SEQ ID NO：3）。

優選的，CFP-10、ESAT-6和EspC蛋白為全序列蛋白或表達抗原活性的部分功能區域多肽。