[發明專利]一種基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其應用

有效

• 申請號: 201510693701.2
• 申請日: 2015-10-24
• 公開（公告）號: CN105316325B
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 唐勛;曾陽;司懷軍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6869
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• 代理人: 暫無信息

本發明一種基于HMGR 3'?UTR和rRNA ITS的引物及其應用提供了三對引物，同時提供了引物獲取方法和應用。本發明的三對引物基于高度特異的3'?UTR和rRNA ITS序列，引物序列特異性高，能夠精確的鑒定五加皮和香加皮樣品。三對引物在五加皮和香加皮全基因組序列未知的情況下采用RACE技術擴增得到下游序列，并通過高通量測序獲得，屬于新發現的序列片段，并具有中藥鑒定的功能。本發明的引物的應用時，樣品提取DNA而不是RNA，這樣對樣品要求較低，可以是鮮品、干品或者簡單炮制后（對DNA破壞低的炮制方法）的樣品。

技術領域

本發明專利涉及分子生物學技術領域，具體地說是一種基于HMGR 3'-UTR和rRNAITS的引物及其應用。

背景技術

3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A生成甲羥戊酸，HMGR是刺五加苷生物合成中的限速酶。刺五加苷是五加皮和刺五加的有效成分，也是品種鑒別和質量鑒定的目標化合物。mRNA 3'端非編碼區（3'-UTR）是mRNA編碼區末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端的一段核苷酸序列。真核生物的3'-UTR在基因表達調控中發揮重要作用，可調控mRNA的穩定性、控制其翻譯、協助辨認密碼子等，3'-UTR在不同基因和不同物種中間具有高度特異性，還可以作為分子標記，特別是植物的次生代謝相關酶。內轉錄間隔區（ITS）是rDNA中18S rRNA基因和28S rRNA基因之間的序列。rDNA上的5.8S、18S和28S rRNA基因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而ITS區不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異。在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性，即使是親緣關系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異。研究表明，ITS片段的進化速率是18S rDNA的10倍。這就是ITS序列應用在中藥材鑒定分析中的理論基礎。

五加皮系五加科植物細柱五加的干燥根皮，為常用中藥。又名白刺、目骨、追風使、南五加皮等。該植物主要分布于湖北，河北，安徽，四川等地。五加皮性溫，味辛、苦，歸肝、腎經，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、通游血、利水腫、鎮痛解熱等功效，臨床主要用于治療風濕瘦痛、腰膝軟弱、小兒行遲、跌打，骨折等病癥，為常用的重要中藥材之一。現代研究證明本品還具有抗腫瘤、抗疲勞、降低全血粘度、防止動脈粥樣硬化形成等作用。

香加皮亦稱北五加皮，來源于蘿藦科植物杠柳的干燥根皮，為常用傳統中藥。本品性溫，味辛苦，有毒，歸肝、腎、心經。有祛風濕、強筋骨的功效。用于風寒濕痹，腰膝酸軟，心悸氣短，下肢浮腫。主產于甘肅、陜西、河南、山西等地。與五加皮藥理作用有異，藥物功效也不相同，五加皮有補肺腎、強筋骨、祛風除濕的功效；香加皮雖也有柱風濕、強筋骨的功效，但與五加皮作用機制不同。香加皮中含有杠柳毒苗，它有劇烈的強心作用但同時又為毒性成分，過量服用甚至會導致死亡。2010版《中國藥典》一部五加皮項下僅規定了性狀、顯微鑒別、水分、總灰分等檢查項，不能準確鑒別，因此應用分子標記和基因工程技術鑒定五加皮和香加皮能夠精確的辨別、鑒定，避免混淆。

發明內容

一、引物序列

本發明提供了一種基于HMGR 3'-UTR和rRNA ITS的引物及其應用。用于鑒定的引物為：

1、基于五加皮HMGR 3'-UTR的引物：上游F1：5^，-ggcatcatgtactaggatacagtcg-3^，

，下游F2：5^，- gtagacagattacattcagtctgactatg -3^，

2、基于五加皮rRNA ITS的引物：上游F3：5^，-cacgacgtgtgcacgactctagtacg-3^，