[發明專利]高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法

有效

• 申請號: 201510690140.0
• 申請日: 2015-10-22
• 公開（公告）號: CN106609263B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 徐國彤;李宗義;高芙蓉;呂立夏
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/0735;C12N5/071
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠

1.一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、將多能干細胞接種到飼養層細胞中，加入干細胞完全培養基，放置培養并定期換液至細胞達到融合狀態；

b、用酶處理多能干細胞成團塊并接種到培養皿中，加入添加有200μg/mL Matrigel的第一誘導分化培養基培養兩天，更換無Matrigel添加的第一誘導分化培養基繼續培養5天；

c、在分化第8天更換第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液至細胞分化形成大量的色素細胞；

d、用酶處理分化細胞成團塊并懸浮培養，1天后進行挑選分離，收集黑色的細胞懸球；

e、將黑色細胞懸球接種于培養皿中，加入第二誘導分化培養基，放置培養并定期換液便可得到成熟的視網膜色素上皮細胞；

步驟a中所述飼養層細胞為X射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞，所述干細胞完全培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/mL ，鏈霉素的濃度為100μg/mL ，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/mL ；所述達到融合狀態為每天換液至細胞達到80％～90％的融合；

步驟b中所述酶處理為5mg/mL 膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述第一誘導分化培養基成分為：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積混合的基礎培養基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，N2體積含量為1％，B27體積含量為1％，青霉素的濃度為100U/mL ，鏈霉素的濃度為100μg/mL ，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；

步驟c中所述第二誘導分化培養基成分為：DMEM/F12基礎培養基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分數為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/mL ，鏈霉素的濃度為100μg/mL ，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述形成大量的色素細胞為隔天換液至分化40天，培養皿中出現大量單層的色素細胞；

步驟d中所述酶處理為5mg/mL 膠原酶IV處理20分鐘并用移液器機械吹打；所述懸浮培養為將細胞團塊接種到不貼壁的細胞培養皿中培養；所述挑選分離為：細胞懸球主要包括黑色與白色兩種，根據顏色進行分離挑選；

所述的多能干細胞為胚胎干細胞。

2.根據權利要求1所述的一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，其特征在于，各步驟中所述培養是在37℃和5％CO₂培養箱中進行。

3.根據權利要求1所述的一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，其特征在于，步驟b或/和步驟e中所述培養皿為有100μg/mL Matrigel包被的細胞培養皿。

4.根據權利要求1所述的一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，其特征在于，步驟c或/和步驟e中所述定期換液為隔天換液。

5.根據權利要求1所述的一種高效誘導多能干細胞向視網膜色素上皮細胞分化的方法，其特征在于，步驟e中所述成熟的色素上皮細胞為具有鵝卵石樣形態，色素積累的單層細胞。