[發明專利]一種纖維二糖水解酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201510687816.0
• 申請日: 2015-10-21
• 公開（公告）號: CN105154416B
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 李瑞;張青;李賓;王華明;黃亦鈞;許麗紅;許韋
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N1/15;C12P7/06;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明涉及酶基因工程改造技術領域，具體涉及一種纖維二糖水解酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO：3，編碼基因的一種核酸序列為SEQ ID NO：4。本發明提供的纖維二糖水解酶突變體比野生型的耐酸性更強，其最適pH為5.0，且在pH3.5?7.0范圍內均能保持65％以上的酶活水平，而野生型的最適pH為5.5。所述纖維二糖水解酶突變體可廣泛應用于木質纖維素的降解，能顯著提高木質纖維素的糖化率。其中，添加本發明所述纖維二糖水解酶突變體MAF6A的實驗組2中木質纖維素的糖化率比對照組提高了6.5％，比添加野生型纖維二糖水解酶AF6A的實驗組1提高了3.5％，取得了意料不到的技術效果。

技術領域

本發明屬于酶基因工程改造技術領域，具體涉及一種纖維二糖水解酶突變體及其應用。

背景技術

纖維素酶(Cellulases)是水解纖維素(β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷鍵)導致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖(cellooligosaccharides)和類似物質的酶。纖維素酶在傳統上已被分為三個主要類型：內切葡聚糖酶(endoglucanases，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucoside glucohydrolase，EC 3.2.1.21)。內切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶體部分，而外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶是唯一可以作用于晶體纖維素的酶組分。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在對于晶體纖維素的有效溶解是必需的。

纖維二糖水解酶由3個部分組成：具有催化活性的催化結構域，作用為錨定纖維素的纖維素結合域以及連接這兩個結構域的一段短肽。在水解纖維素過程中，纖維二糖水解酶主要作用于纖維素線性分子非還原端，水解β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子，使結晶纖維素成為易溶解的非結晶纖維素。

當前經濟過分依賴于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性導致資源逐漸枯竭，燃燒產生的二氧化碳已造成氣候環境的日益惡化。尋找可再生的清潔能源成為各國科研人員關注的焦點。其中生物質能源因具有來源廣泛、價格低廉、再生性強等優點，成為最具潛力的能源物質。生物乙醇是源于可再生物質的重要能源之一。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，全球每年通過光合作用產生的植物約10000億噸，為避免與人爭糧，木質纖維素將成為生物乙醇生產最具潛力的原料。

木質纖維素煉制生物乙醇過程通常包括預處理、水解、發酵、蒸餾等單元操作，其中纖維素水解為可發酵糖是纖維素乙醇煉制過程中至關重要的環節。目前，木質纖維素的降解主要有化學法和酶法水解。與化學法水解相比，酶法水解工藝條件溫和，設備簡單，能耗低，同時具有副產物少、環境友好等特點，受到廣泛重視并取得重大進展。

由于木質纖維素中的纖維素主要以結晶狀態存在，因此纖維二糖水解酶在木質纖維素水解中的作用相當重要。但目前現有的纖維二糖水解酶活力低，耗酶量大，發酵成本高，且其在酸性條件下的酶解效率和轉化率普遍偏低，嚴重限制了木質纖維素在生物乙醇生產中的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種纖維二糖水解酶變體及其應用。本發明通過對纖維二糖水解酶進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白。所述突變體在酸性條件下的酶活力得到顯著提高，且耐熱性更強，能大大提高木質纖維素的降解效率，進而促進其在生物乙醇生產中的應用。

本發明一方面提供了一種纖維二糖水解酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO：1的纖維二糖水解酶第158位氨基酸由Asp變為Asn，第298位氨基酸由Asp變為Ser，第444位氨基酸由Glu變為Val。

上述纖維二糖水解酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，其編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO：4。

本發明另一方面提供了一種重組質粒，其攜帶有編碼序列為SEQ ID NO：4的纖維二糖水解酶突變體的基因。