[發(fā)明專利]在胞內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性的免疫球蛋白構(gòu)架及其鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510685456.0
• 申請日: 2003-05-21
• 公開（公告）號: CN105175535A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: K·緹索特;S·艾沃特;A·奧弗德爾茂爾;A·巴伯里斯;D·艾施爾
• 申請（專利權(quán)）人: 艾斯巴技術(shù)-諾華有限責(zé)任公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N15/13;G01N33/53;A61K39/395
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 鄭天松

本申請是2003年5月21日提交的同名發(fā)明專利申請03814626.6、201010575786.1及20141003195.3的分案申請。

【發(fā)明領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)。

【相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域背景】

抗體能以高度的特異性和親和力識別并靶向幾乎任何分子。這個特點已被開發(fā)，以便將這些天然蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜谠\斷和治療應(yīng)用的強(qiáng)有力的工具。重組DNA技術(shù)的進(jìn)展已推動了抗體基因在廣泛種類的非淋巴細(xì)胞中的操作、克隆和表達(dá)(Skerra,1988；Martineau,1998；Verma,1998)。已經(jīng)構(gòu)建了許多不同的抗體片段，以便最佳地滿足各種應(yīng)用。保留整個母體免疫球蛋白全部抗原結(jié)合能力的最小實體是單鏈Fv片段(scFv)(Bird,1988)。該抗體片段包含由柔性肽接頭連接起來的重鏈和輕鏈可變區(qū)，這使得該蛋白能夠由單個基因表達(dá)。

抗體片段較之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的優(yōu)勢。由于分子小，它們在多種表達(dá)宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)得以易化、且產(chǎn)量得以提高(Plückthun,1996)。而且，抗體片段允許在體內(nèi)應(yīng)用中改善腫瘤穿透力(Yokota,1992)，并且它們能夠與多種用于治療途徑的效應(yīng)分子共價連接。

天然存在的抗體是由漿細(xì)胞分泌的，已進(jìn)化至能夠在胞外氧化環(huán)境中行使功能。為獲得其功能性折疊結(jié)構(gòu)，它們通常需要在不同結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成二硫鍵，這對于免疫球蛋白折疊是至關(guān)重要的。與全長抗體形成對照，scFv或Fab抗體片段原則上能夠在任何細(xì)胞內(nèi)部的還原環(huán)境中功能性地表達(dá)，并定向到任何區(qū)室，以靶向胞內(nèi)蛋白，從而引發(fā)特定的生物學(xué)效應(yīng)(Biocca,1991)。的確，有些稱之為內(nèi)體(intrabodies)的胞內(nèi)單鏈抗體片段，已被成功地用于調(diào)節(jié)不同的生物系統(tǒng)中胞內(nèi)靶蛋白的功能。從而，針對病毒侵染的抗性已在植物生物技術(shù)中得到展示(Tavladoraki,1993；Benvenuto,1995)，內(nèi)體與HIV蛋白的結(jié)合業(yè)已證明(Rondon,1997)，并且與癌基因產(chǎn)物的結(jié)合(Biocca,1993；Cochet,1998；Lener,2000)也已有描述。而且胞內(nèi)抗體在表征目前通過人類基因組測序鑒定到的大量基因的功能方面有希望成為有價值的工具(Richardson,1995；Marasco,1997)。例如，它們可在功能基因組途徑中用于封閉或調(diào)節(jié)新近鑒定的蛋白的活性，由此促成對其功能的了解。最后，內(nèi)體具有診斷和治療應(yīng)用的潛力，例如在基因治療環(huán)境中。

盡管存在極大的前景，功能性內(nèi)體的產(chǎn)生仍然受限于其不穩(wěn)定性和不可溶性或者聚集的傾向。胞漿的還原環(huán)境防止形成保守的鏈內(nèi)二硫橋，從而使得高百分比的抗體片段不穩(wěn)定，因此在細(xì)胞內(nèi)無功能(Biocca,1995；Proba,1997)。抗體片段的穩(wěn)定性和可溶性因此構(gòu)成了內(nèi)體在體內(nèi)作為潛在的蛋白功能調(diào)解劑的應(yīng)用的主要障礙。迄今為止，尚不可預(yù)言使得抗體片段在胞內(nèi)環(huán)境中具備功能的序列要求。

因此，急需在廣范圍的不同細(xì)胞類型中性能良好的抗體片段，從而可作為用于多種結(jié)合特異性的構(gòu)架。此類構(gòu)架可用于構(gòu)建用于胞內(nèi)篩選的文庫，或者可作為既有抗體結(jié)合部分的受體。

除了獨特地滿足胞內(nèi)應(yīng)用之外，在眾多的胞外和體外應(yīng)用中，基于極為穩(wěn)定的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架的此類抗體片段或完整抗體相比于其它抗體也具有獨特的優(yōu)勢。當(dāng)此類構(gòu)架在氧化環(huán)境中產(chǎn)生時，其二硫橋能夠形成，進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性，并使得它們高度抵抗聚集和蛋白酶降解。體內(nèi)半衰期(及針對聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了親和力和特異性之外的、使抗體在治療或診斷應(yīng)用中成功的唯一最為重要的因素(Willuda,1999)。抗體片段的半衰期可通過共價連接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而進(jìn)一步得以提高(Weir,2002)。這類穩(wěn)定分子代表了抗體應(yīng)用的顯著進(jìn)步，尤其但并不僅當(dāng)不期望F_C功能時。

抗體片段文庫極大的實踐重要性激發(fā)了該領(lǐng)域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗體可變區(qū)基因的初始克隆和表達(dá)。由這些基因出發(fā)，他建立了在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及構(gòu)架區(qū)具有高度多樣性的巨大抗體文庫。不過，Winter未披露不同構(gòu)架用于文庫構(gòu)建的用途。

另一方面，Plückthun(EP0859841)教導(dǎo)試圖通過將構(gòu)架限于有限數(shù)目的合成共有序列而改進(jìn)文庫設(shè)計。包括引入大量合理設(shè)計的突變的蛋白質(zhì)工程的努力以前就提示針對相應(yīng)共有序列的突變是提高分離的可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性的合適手段(Ohage1999；Ohage1999以及US5,854,027,特此并入作為參考)。