[發明專利]一種利用生物質譜技術快速檢測僵蠶蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201510665772.1
• 申請日: 2015-10-16
• 公開（公告）號: CN105203677A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 沈玉萍;楊歡;徐瑩;余江南;陳慧卿;曹進;夏國華
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;G01N30/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種利用生物質譜技術快速檢測僵蠶蛋白質的方法，屬于中藥技術領域。

背景技術

僵蠶（BombyxBatryticatus），為蠶蛾科昆蟲家蠶（BombyxmoriLinnaeus）4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）真菌門半知菌綱的球孢白僵菌（BeauveriabassianaBals.Vuillant）而致死的干燥蟲體，又稱白僵蠶、僵蟲、姜蟲、天蟲等。僵蠶性平，味咸、辛；入肝、心、脾、肺四經。僵蠶能祛風熱、息風止痙、祛風止痛、活絡通經、化痰鎮咳、解毒散結等。主治小兒驚癇、咽喉腫痛、頭痛、中風抽搐、半身不遂、丹毒、乳腺炎等。

僵蠶是常見的中藥動物藥，療效確實、藥用價值高，年需求量在400噸以上，且常年外銷出口。僵蠶偽品大多為用石灰水將死家蠶摻白加工而成，也有將地蠶冒充正品僵蠶使用。近年來，出現了新的偽品黑死蠶和空心僵蠶，由于外觀、顯微等均與正品相似，難以應用常規方法進行有效鑒別。中藥僵蠶的化學成分主要為蛋白質、氨基酸、脂肪等物質，如亮氨酸、天冬氨酸以及變態活性融激素等，而蛋白質具有較高的種屬和組織特異性，因此僵蠶的鑒別可以選擇其所含有的蛋白質作為識別物。

目前，僵蠶的質量評價仍然主要依靠傳統的生藥學鑒別方法，即從外觀、色澤、質地、氣味等方面來評價真偽優劣，其經驗依賴性強、準確性較低。對于僵蠶中豐富的蛋白質類化學成分，邱乙等（邱乙，汪云偉，程元柳，等.《基于差異蛋白質鑒別僵蠶及其新型偽品》，吉林中醫藥，2014年10期）通過分析總蛋白含量、可溶性蛋白含量差異以及應用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術尋找差異蛋白質來鑒別僵蠶與偽品黑死蠶、空心僵蠶。但是，該方法存在步驟繁瑣、時間和試劑消耗大、SDS-PAGE不能準確測定蛋白質分子量等固有缺陷。

基質輔助激光解吸附-飛行時間（MALDI-TOF）生物質譜技術具有檢測速度快（以秒計）、單次分析檢測樣品多（384個）、測定分子量范圍寬（500～500000Da）、測定結果準確、重復性好等優勢；此外，相比其他鑒定手段，MALDI-TOF生物質譜技術穩定性更高，而且樣品處理簡便、消耗少、耐高濃度鹽、緩沖劑和其他非揮發性成分的優點。因而，使用MALDI-TOF分析僵蠶中的蛋白質是一種比較合理且有效的手段。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術難以準確獲得僵蠶蛋白質的分子量信息，也缺乏整體質量的量化檢測指標，與現代醫藥的發展要求不相適應，提供一種基于MALDI-TOF生物質譜技術快速檢測僵蠶蛋白質的方法，為動物藥僵蠶的準確鑒定提供方案。

本發明通過以下步驟達到快速檢測僵蠶蛋白質的目的：

一種利用生物質譜技術快速檢測僵蠶蛋白質的方法，首先制備供試品溶液，利用生物質譜技術快速檢測。

其中供試品溶液的制備方法按照下述步驟進行：

1）將僵蠶粉碎，得細粉，加入適量水，超聲提取，離心后取上清液；

其中，所述僵蠶細粉量與加入水的量的比例為1mg：10-60μL；所述超聲提取時間為30分鐘；所述離心條件為12000r/min離心15分鐘。

2）將上清液緩慢加入飽和硫酸銨水溶液中，渦旋數秒，4℃靜置過夜；

其中所述加入飽和硫酸銨水溶液的量與步驟（1）中加入水的量體積比為30-50：1。

3）將混合溶液再次離心，棄去上清液，收集沉淀；

其中，所述離心條件為12000r/min離心15分鐘。

4）將上述沉淀用適量水溶解，得到樣品溶液；

5）使用反相鍵合固相萃取C4Ziptip吸附樣品溶液中的蛋白質，以乙腈洗脫，得到供試品溶液；

其中所述乙腈濃度為70%~90%，用量為5~10μL。

一種利用生物質譜技術快速檢測僵蠶蛋白質的方法，檢測方法按照下述步驟進行：

1）吸取供試品溶液0.5~1μL，點樣，再取飽和3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸基質溶液0.5~1μL，混合，揮干；

2）將樣品板載入MALDI-TOF質譜儀中進行分析。

3）MALDI-TOF檢測參數

AcceleratingVoltage：25kV

GridVoltage%：95%

GuideWireVoltage%：0.15%

DelayTime：450nsec

InputBandwidth：25MHz

DigitizerBinsize：1nsec