[發明專利]一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法

在審

• 申請號: 201510664007.8
• 申請日: 2015-10-15
• 公開（公告）號: CN105165624A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: 馬慶旭;吳良歡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/00;A01G7/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）無菌苗的培育：選取飽滿的植物種子，在常溫下浸泡12h，之后采用70%酒精浸泡1分鐘-無菌水沖洗3次-10%過氧化氫浸泡5分鐘-無菌水沖洗3次-0.1molL^-1氯化汞浸泡5分鐘-無菌水沖洗5次的滅菌方法，之后將滅菌后的種子放置于已高壓滅菌的培養皿中發芽3-5天，待植物根系生長至約1cm，將一粒種子放置于已滅菌的裝滿0.5%瓊脂的50ml離心管中，置于無菌培養臺上培養1-3天，植物通過離心管蓋子中心的直徑為0.3cm的小孔長出，采用南大704硅橡膠密封小孔，待硅膠定型后添加營養液；

（2）長期光照強度對植物選擇性吸收氮源的影響：供試氮源為NO₃^-、NH₄⁺、甘氨酸三種，等氮量混合，總濃度為3mM，且每次只標記其中一種氮源，標記物豐度值為50.22at.%¹⁵NO₃^-、50.17at.%¹⁵NH₄⁺、50.16at.%¹⁵N-甘氨酸，光照強度為36、162、288、414、540μmolm^-2s^-1五個梯度，共15個處理，采用離光源距離的遠近來控制光照強度，每種光照強度處理設置一空白，以檢測自然豐度，每三天更換一次營養液，培養25天后，測定植物地上部及根系的生物量及¹⁵N豐度；

（3）短期特定光照強度對植物吸收氮源的影響：以3mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，采用步驟（1）方法無菌培養植物25天，取長勢基本一致的植物幼苗，采用無菌水將離心管及植物根系多次沖洗，放置在無菌水中培養一整夜，將植物放置于含3mM98.10at.%¹⁵N-甘氨酸的溶液中，以90、360、540μmolm^-2s^-1三個光照強度處理，吸收4h后破壞性采樣；

（4）短期特定光照強度對植物吸收氮源方式的影響：以3mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，采用步驟（1）方法無菌培養植物25天，取長勢基本一致的植物幼苗，用無菌水將離心管及植物根系沖洗，放置在無菌水中“饑餓”培養一整夜，選取6株長勢一致的植物幼苗，將其根系預先放置于50μmolL^-1CCCP溶液中1小時，使其根系失活，然后以不用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM98.10at.%¹⁵N-甘氨酸的溶液中，以90、360、540μmolm^-2s^-1三個光照強度處理，進行標記氮源的短期吸收方式試驗，吸收4h后破壞性采樣；

（5）樣品處理：經過步驟（2）長期吸收和步驟（3）、（4）短期吸收的植物樣品采收后，將地上部和地下部分開，植物根系先用超聲波清洗，然后用0.5molL^-1CaCl₂清除吸附在根系表面的氮素，最后用無菌水沖洗干凈，并用吸水紙吸干，植物根系和地上部樣品用凍干機冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏定氮儀蒸餾，最后用0.01molL^-1硫酸滴定，采用同位素質譜儀測定植株不同部位的¹⁵N豐度值；

（6）測定氮源：

植物對某一氮源的吸收是根據植物體內的¹⁵N含量來確定，采用以下公式計算：

N_uptake指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量;A_s是植物根系或者地上部的¹⁵N豐度值;A_c指的是未添加標記氮源的¹⁵N空白豐度值;A_f是混合氮源中某一標記氮源的豐度值，在長期光照對植物吸收氮源的影響中，為50.16%甘氨酸、50.22%NO₃^-、50.17%NH₄⁺，在短期吸收中，為98.10%甘氨酸；指的是植物地上部或根系的總氮量。