[發(fā)明專利]一種皮膚修復(fù)功能提高的人脂肪干細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510658857.7
• 申請日: 2015-10-14
• 公開（公告）號: CN105154407B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳建勛;黃啟明;嚴(yán)蘭蘭;廖文敏
• 申請（專利權(quán)）人: 紫程瑞生會(北京)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/867;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種皮膚修復(fù)功能提高的人脂肪干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括構(gòu)建含三個(gè)細(xì)胞生長因子的融合基因片段，重組到慢病毒表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞，制備成可高表達(dá)含三個(gè)細(xì)胞生長因子融合蛋白的脂肪干細(xì)胞；即所述細(xì)胞生長因子為堿性成纖維生長因子(bFGF)、血小板衍生因子(PDGF)和角質(zhì)細(xì)胞生長因子2(KDF2)；

按照熒光定量PCR試劑盒的使用說明書進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)染了重組fpk慢病毒表達(dá)載體的人脂肪干細(xì)胞傳代培養(yǎng)到第10代后，其表達(dá)fpk基因高于未轉(zhuǎn)染的人脂肪干細(xì)胞75倍以上；

所述人脂肪干細(xì)胞過表達(dá)細(xì)胞生長因子，流式細(xì)胞檢測-脂肪干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和CD44表達(dá)90％以上；

其中，構(gòu)建含三個(gè)細(xì)胞生長因子的融合基因片段的方法為：將人bFGF、PDGF和KDF2列通過PCR從正常人外周血基因組DNA中擴(kuò)增下來，在人bFGF cDNA設(shè)計(jì)反鏈含連接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，PDGF設(shè)計(jì)在正鏈含連接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反鏈含連接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一對引物，KDF2設(shè)計(jì)在正鏈含連接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通過PCR方法將三者擴(kuò)增連接在一起，形成完整的含人bFGF、PDGF和KDF2的DNA，兩者之間由表達(dá)連接DNA鏈接，即bFGF-L-PDGF-L-KDF2，其簡寫為fpk；

將bFGF-L-PDGF-L-KDF2的目的DNA片段和pUC227載體Hind III/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37℃、12小時(shí)連接反應(yīng)制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a后進(jìn)行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合bFGF-L-PDGF-L-KDF2大小和序列正確后，將測序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，抽提合格的重組質(zhì)粒放置-80℃超低溫冰箱中長期保存；所述bFGF-L-PDGF-L-KDF2大小為1738bp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人脂肪干細(xì)胞來源腹部脂肪、大腿脂肪或手臂脂肪。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人脂肪干細(xì)胞來源腹部脂肪。