[發(fā)明專利]沙地云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510648772.0
• 申請日: 2015-10-10
• 公開（公告）號: CN105165618A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白玉娥;何炎紅;葉冬梅;代金玲;彭鵬;曾超
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 呼和浩特北方科力專利代理有限公司 15100
• 代理人: 徐小明

1.一種沙地云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）將成熟的沙地云杉種子用清水浸泡12～15h，將漂浮于液面的種子舍棄，余下的種子用自來水沖洗3～4次；在超凈工作臺中，將云杉種子先用70～75%酒精浸泡28～32s后用無菌水清洗3～5次,再用2%次氯酸鈉溶液消毒12min,然后用無菌水沖洗3～5次；

（2）將經(jīng)步驟（1）處理過的種子以手術(shù)刀剝?nèi)⊥暾姆N胚后，接種于下列培養(yǎng)基中：LM培養(yǎng)基+6-BA（2～5mg/L）+2,4-D（4～8mg/L）+KT（0.5～2.0mg/L）+蔗糖（30g/L）+結(jié)冷膠（2g/L），pH控制在5.6～5.8、溫度為22±2℃、暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)20～25d生成愈傷組織；

（3）將步驟（2）所述的愈傷組織接種于以下培養(yǎng)基中：1/2～1/4LM培養(yǎng)基+6-BA（1～4mg/L）+2,4-D（1～5mg/L）+KT（0.1～1.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+結(jié)冷膠（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、溫度為22±2℃、暗條件下進行繼代培養(yǎng)20～25d使愈傷組織進一步生長；

（4）將步驟（3）所述的愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：1/2～1/4LM培養(yǎng)基+6-BA（1.0～1.9mg/L）+2,4-D（1.0～1.9mg/L）+KT（0.1～0.5mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+結(jié)冷膠（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、溫度為22±2℃、暗條件下進行繼代培養(yǎng)20～25d,得到淡黃色緊密結(jié)構(gòu)的非胚性愈傷組織與白色半透明絲狀的胚性愈傷；

（5）將步驟（4）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：1/2～1/4LM培養(yǎng)基+6-BA（0.1～1.0mg/L）+2,4-D（1.0～3.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+結(jié)冷膠（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、溫度為22±2℃、暗條件下進行增殖培養(yǎng)，每隔20～25d以相同配方繼代培養(yǎng)進行增殖；

（6）將步驟（5）所述的胚性愈傷組織接種于下列培養(yǎng)基中：1/2～1/4LM培養(yǎng)基+ABA（15～20mg/L）+PEG4000（40～50g/L）+蔗糖（20～30g/L）+結(jié)冷膠（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、溫度為22±2℃、暗條件下進行分化培養(yǎng)，每隔20d以相同配方進行繼代培養(yǎng)；40～60d后即長出云杉體細(xì)胞胚；

（7）將步驟（6）所述的體細(xì)胞胚接種于1/2～1/4LM培養(yǎng)基+蔗糖（20～40g/L）+結(jié)冷膠（3～7g/L）+PEG4000（50～80g/L）培養(yǎng)7d以上，將體胚平鋪于兩層濕潤的濾紙上，放在一個無菌培養(yǎng)皿中干化處理7天，每個培養(yǎng)皿放置約150個體細(xì)胞胚，以上過程均在培養(yǎng)溫度為22±2℃、光照條件為1200Lx、光照時間為14h/d的條件下進行從而達到干化目的；（8）將步驟（7）所述的完成干化的體細(xì)胞胚接種于1/4～1/2LM培養(yǎng)基+蔗糖（20～30g/L）+瓊脂（5～8g/L）,30d后即可萌發(fā)并長成帶根的鍵壯云杉幼苗。