[發(fā)明專利]一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510639836.0
• 申請日: 2015-10-08
• 公開（公告）號: CN105112344A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔勁松;侯瓔朔;羅陽;翟靖鑫;張楠;朱佳能;史勁松;許正宏;李恒
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/48;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌及其粗酶性質(zhì)。

背景技術(shù)

角蛋白酶（Keratinases）是一種能專一降解天然角蛋白的蛋白水解酶。角蛋白存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成環(huán)境污染。

角蛋白酶可用于制革工業(yè)。目前制革工業(yè)中脫毛基本采用灰堿法，但是脫毛廢液中含有高濃度的硫化物，嚴(yán)重污染環(huán)境，而用酶法代替灰堿法脫毛便可徹底消除硫化物的污染，酶法具有清潔性、環(huán)境友好等特征，同時(shí)相比化學(xué)制革工藝更能提高產(chǎn)品的質(zhì)量，因此在制革中應(yīng)用已越來越廣泛

角蛋白酶可用于醫(yī)藥行業(yè)。我國每年產(chǎn)生大量的家禽羽毛和廢次羊毛，其主要成分是角蛋白。角蛋白酶可將家禽羽毛、廢次羊毛降解轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿鞍踪|(zhì)、多肽或者氨基酸，用作醫(yī)藥原料、動(dòng)物飼料等，變廢為寶，減少環(huán)境污染。

目前已發(fā)現(xiàn)30多種微生物能分泌角蛋白酶，國內(nèi)外角蛋白酶的研究主要集中在真菌中的皮膚癬菌和白假絲酵母（Candidaalbicans），放線菌中的鏈霉菌（Streptomyces）和高溫單胞菌屬（Thermonspora）及細(xì)菌中的地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）等。

本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌，并初步研究了其使用方法。

發(fā)明內(nèi)容

（1）平板初篩：從江蘇無錫農(nóng)村羊圈采集土壤樣品，取1g土樣添加到10mL生理鹽水中，制備土壤懸液，稀釋涂布至初篩培養(yǎng)基平皿中，30℃培養(yǎng)3d。在分離平板上挑取能生長的較大的單菌落，劃線分離至純單菌落。

（2）搖瓶復(fù)篩：初篩得到的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測定其上清液角蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)7號菌酶活力較高。

（3）菌株16SrDNA鑒定：提取總DNA，用細(xì)菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增，得到的基因序列，經(jīng)測序比對，為副短短芽孢桿菌(Brevibacillusparabrevis)，命名為R-7，于2015年5月11日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.10798。

（4）菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化：利用單因素及正交實(shí)驗(yàn)對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為羊毛1%，可溶性淀粉1%，玉米粉1%，NaCl0.15%，NH₄Cl0.05%，K₂HPO₄0.03%，KH₂PO₄0.04%，MgCl₂·6H₂O0.01%。搖床培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度40℃，轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量30mL/250mL，發(fā)酵周期16h，產(chǎn)角蛋白酶活力達(dá)到412U/mL。

（5）酶學(xué)性質(zhì)研究：分別研究了作用溫度和作用pH對該酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)該角蛋白酶的最適作用溫度為40℃，最適pH為7.0。

其中步驟（1）中所述的初篩培養(yǎng)基為：羊毛粉0.5%，K₂HPO₄0.1%，NaCl0.05%，瓊脂粉2%；步驟（2）中所述的復(fù)篩搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：MgCl₂·6H₂O0.01%，K₂HPO₄0.03%，KH₂PO₄0.04%，NaCl0.05%，NH₄Cl0.05%，羊毛1%。

附圖說明

圖1為溫度對酶活力的影響

圖2為pH對酶活力的影響

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1角蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選與鑒定

(1)培養(yǎng)基配方

①初篩培養(yǎng)基：羊毛粉0.5%，K₂HPO₄0.1%，NaCl0.05%，瓊脂粉2%。

②種子液體培養(yǎng)基