[發明專利]堿性磷酸酶(NAP)染色液(化學染色法)

有效

• 申請號: 201510631201.6
• 申請日: 2015-09-29
• 公開（公告）號: CN105181423B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 謝永華;朱美萍;許付
• 申請（專利權）人: 上海太陽生物技術有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及堿性磷酸酶(NAP)染色液(化學染色法)，即一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法。

背景技術

堿性磷酸酶(NAP)主要存在于成熟中性粒細胞，是一種胞內非特異性水解酶，在堿性條件下能水解多種磷酸酯。隨著細胞的成熟，NAP的活性也逐漸增強。在病理情況下，不同疾病及疾病的不同階段均可引起NAP成分與含量的變化，因此，作為快速測定堿性磷酸酶活性的化學染色法經常被用作各種疾病的臨床輔助診斷指標。NAP活性變化對某些疾病的鑒別與診斷具有重要的臨床價值：當患有慢性粒細胞白血病時(無繼發感染時)，其活性顯著減低，緩解期可恢復至正常范圍，加速期和急變期時，NAP活性可不同程度增高，該檢測可作為觀察慢粒白血病療效和預后的一項指標，也是與類白血病反應鑒別的重要檢測項目。急性粒細胞白血病，NAP活性降低，并發感染時可稍增高。NAP活性減低還常見于病毒感染或寄生蟲、立克次體感染，惡性組織細胞增生癥和淋巴瘤等。至于中性粒細胞堿性磷酸酶活性增高的情況則比較多見，如妊娠16W～20W孕婦，NAP水平顯著增高，其他如細菌性炎癥、類白血病反應、再生障礙性貧血、特發性血小板減少性紫癜、多發性骨髓瘤、真性紅細胞增多癥、急性淋巴細胞白血病等也伴隨有NAP積分增高現象。

堿性磷酸酶的染色方法主要有金屬鹽沉淀法和偶氮偶聯法。

金屬鹽沉淀法中最經典的是Gomori的鈣鈷法，其原理是以β-甘油磷酸為底物，在pH9.3的堿性條件下水解為磷酸鈉和甘油，磷酸鈉與鈣離子作用生成磷酸鈣，再與鈷離子作用生成磷酸鈷，后者與硫化銨作用生成不溶性硫化鈷沉淀。由于鈣鈷法存在操作繁瑣、費時、有特殊不良氣味、硫化銨污染等缺點，目前醫療臨床上已經很少應用。

1955年kaplow LS提出了用偶氮偶聯法對細胞中的堿性磷酸酶進行染色，其原理是利用堿性磷酸酶在pH9.2-9.8的堿性環境下，水解α-磷酸萘酚鈉，產生α-萘酚，后者與重氮劑偶聯成有色沉淀物的原理進行染色。但是，α-萘酚為未取代萘酚，與偶氮的有效偶聯需要加入過量的重氮鹽，對酶活性可能造成阻抑作用，其分解產物對細胞具有非特殊性染色作用，且每次試驗需要臨時配制孵育液。后期有許多學者找到了α-磷酸萘酚鈉鹽的替代品，如萘酚AS-BI磷酸鈉鹽、萘酚AS-MX磷酸鈉鹽，應用該方法染色具有快速、簡便、容易重復等優點，但始終存在陽性染色不明顯、顯色靈敏度偏低等問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供堿性磷酸酶(NAP)染色液(化學染色法)，即一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法，使所述試劑盒以及染色方法應用于血細胞內堿性磷酸酶檢測時能夠提高陽性染色效果。

本發明的另一個目的在于提供一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法，使所述試劑盒以及染色方法應用于血細胞內堿性磷酸酶檢測時能夠提高顯色靈敏度。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒，包括pH值為9.2-9.8的堿性磷酸酶底物溶液，所述堿性磷酸酶底物為N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。

作為優選，所述N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺濃度為0.125mg/ml～1mg/ml，更優選0.25mg/ml～0.5mg/ml，其分子結構如下：

與傳統較常用的底物萘酚AS-BI磷酸鈉鹽、萘酚AS-MX磷酸鈉鹽相比，本發明試劑采用的底物在原有發色基團萘甲酰的N位上引入了另一發色基團聯苯基，且在聯苯基的2位和5位分別用助色基團甲基和甲氧基取代，可以增強堿性磷酸酶水解底物產生的萘酚與偶氮鹽反應的顯色強度，從而大大提高了堿性磷酸酶的顯色靈敏度。

所述堿性磷酸酶底物N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成方法為：以2-羥基-3-萘甲酸(化合物1)和5-甲基-4-苯基鄰茴香胺(化合物2)為原料，三氯化磷為羧基和氨基的縮合劑，獲得3-羥基-N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯苯基)-2-萘甲酰胺(化合物3)；再通過五氯化磷磷酸化，最終獲得N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺(化合物4)。

合成路線如下：

作為優選，所述堿性磷酸酶底物溶液中還包括基質緩沖液、穩定劑、防腐劑和無機鹽。