[發明專利]Cas9介導的家蠶基因編輯載體和應用

有效

• 申請號: 201510630939.0
• 申請日: 2015-09-29
• 公開（公告）號: CN105132460B
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 潘敏慧;魯成;董戰旗;胡楠;陳婷婷;陳鵬
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A01K67/04
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 王貴君

本發明公開了Cas9介導的家蠶基因編輯載體，包括組成型基因編輯載體和誘導型基因編輯載體，其中組成型基因編輯載體包括U6啟動子調控sgRNA表達的表達框U6?sgRNA和IE?1啟動子調控Cas9表達的表達框，誘導型基因編輯載體Cas9由Hr3?39k誘導型啟動子調控表達，本發明的Cas9介導的基因編輯載體能夠穩定、高效編輯目的基因，為制備昆蟲抗病毒轉基因素材和具有高效抗病毒的品種提供了有力的工具。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及Cas9介導的家蠶基因編輯載體，還涉及該基因編輯載體的應用。

背景技術

CRISPR/Cas9基因編輯技術是細菌和古細菌在噬菌體長期選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機制之一。是由一段RNA通過堿基互補配對識別DNA，指導Cas9核酸內切酶切割識別的雙鏈DNA，誘發同源重組或非同源末端連接，進而實現在目的DNA上進行編輯。因為這一新系統相比以前的基因編緝系統具有制備簡單、成本低、作用高效等優點，開發后獲得了快速發展等優點。因此，基于CRISPR/Cas9基因編輯技術在持續感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在意義。

CRISPR/Cas9系統工作的基本原理是當病毒或噬菌體感染宿主細胞時CRISPR被轉錄為長的RNA前體(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區的成熟crRNA(CRISPR-derived RNA)，最終識別并結合到與其互補的外源DNA序列上。并引導Cas9核酸內切酶在靶位點剪切雙鏈DNA，隨后，細胞的非同源末端連接修復機制(NHEJ)重新連接斷裂處的基因組DNA，并引入插入或缺失突變，引起靶標基因錯誤的轉錄翻譯，從而使基因喪失功能。這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)進行簡化。因此，這一簡化的CRISPR/Cas9基因編緝系統能夠準確、快速、直接清除入侵的外源DNA。

家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目模式昆蟲。BmNPV是蠶業生產上最常見的且危害最嚴重的一類病原，對蠶業生產影響巨大。利用當今發展迅速的基因工程技術，從根本上提高家蠶病毒抗性，是蠶業領域重要的研究課題?；虻那贸芯勘砻?，缺失某些增殖必需基因，BmNPV將不能增殖。因此，抑制這些病毒增殖必需基因的表達將成為防治家蠶感染BmNPV的一種有效策略。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以BmNPV增殖必需基因為靶基因而構建基因編緝載體，再將其導入家蠶細胞并持續表達能夠導致BmNPV增殖必須基因發生插入或缺失從而喪失功能，是防治家蠶感染BmNPV和培育家蠶抗病毒品系的有效手段。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供Cas9介導的家蠶基因編輯載體；本發明的目的之二在于提供含有Cas9介導的家蠶基因編輯載體的轉化子，本發明的目的之三在于提供Cas9介導的家蠶基因編輯載體的應用。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

Cas9介導的家蠶基因編輯載體，包括U6啟動子調控sgRNA表達的表達框U6-sgRNA和IE-1啟動子調控Cas9表達的表達框。

優選的，還包括熒光標記系統。

更優選的，所述熒光標記系統為Mcherry紅色熒蛋白。

優選的，所述Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表達框U6-sgRNA含有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，IE-1啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

更優選的，所述Mcherry紅色熒蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

優選的，所述Cas9由SEQ ID NO.18所示的Hr3-39k誘導型啟動子調控表達。