[發明專利]一種生物磁分離篩選抗真菌活性抗菌肽的方法

在審

• 申請號: 201510622312.0
• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN105132508A
• 公開（公告）日: 2015-12-09
• 發明（設計）人: 李莉蓉;陳璇;韓鵬;宋風霞
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/16;C07K1/14
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種生物磁分離結合高效液相指紋圖譜技術快速準確、大量篩選、制備苦蕎粗蛋白水解抗真菌抗菌肽的工藝，屬于生物活性肽的制備領域。

背景技術

致病性真菌對人類感染的發病率一直在增長，特別是一些免疫低下的患者正面臨無藥可治的境地，不可治愈的真菌性感染疾病和真菌耐藥菌株的擴散已成為人類健康的一大威脅。

抗菌肽也稱為宿主防御肽，是機體抵御外來微生物威脅的第一道防線，屬于抗生素的家族，它們對細菌、真菌、原生動物、腫瘤細胞、病毒等都具有毒性，可作為常規抗生素治療，還具有抗生素協同作用、中和內毒素、免疫調節等作用。但天然存在的抗菌肽含量較低，制備上一直沿用傳統活性肽制備方法，樣品制備繁瑣且得率低，所以改進獲得高效快速的制備方法是抗菌肽高效規模制備的關鍵。食源性蛋白來源廣泛、價格低廉，且經過蛋白酶水解后可產生具有抗菌、抗氧化、調節血糖、調節血壓等多種功能的活性肽。

生物磁分離技術是將磁性納米材料應用于細菌、核酸等生物體的新興高效分離技術，具有價格低、無毒、過程簡單、高效、條件溫和等優點。以磁性納米粒子為核心，包覆模擬真菌細胞膜的脂質體制成磁性納米脂質體，可實現磁性納米粒子和脂質體兩種膠體的結合且仍保持各自性質。

抗菌肽與致病性真菌細胞膜的特異性相互作用是其發揮膜損傷活性機制和跨膜胞內活性作用機制的前提和基礎。利用部分抗菌肽與真菌細胞膜間選擇性結合的特點，最大限度模擬抗菌肽與真菌細胞膜作用的生理條件，在外加磁場作用下具有細胞膜結合活性的抗菌肽能與磁性納米脂質體結合而有磁性，能在磁場中停留，實現目標活性肽的快速分離。目前國內外未見以磁性脂質體篩選制備抗真菌活性抗菌肽的相關文獻報道。

本發明利用生物磁分離結合高效液相指紋圖譜技術快速篩選制備苦蕎粗蛋白水解抗真菌抗菌肽。

發明內容

本發明提供一種生物磁分離結合高效液相指紋圖譜技術快速準確、大量篩選及制備食物源蛋白質抗真菌活性抗菌肽的方法，包括如下步驟：

（1）粗蛋白酶解抗真菌抗菌肽的制備；

（2）磁性真菌細胞膜脂質體的制備；

（3）生物磁分離結合高效液相指紋圖譜技術快速篩選抗真菌活性抗菌肽。

上述方法的具體操作為：

（1）調節食源性蛋白原料粉與石油醚的料液比為1:4～1:8，用石油醚回流脫脂3～6h得脫脂原料粉，在脫脂原料粉中添加蒸餾水，調節脫脂原料粉的料液比1:6～1:20，pH值至7.0～9.0，在4～25℃、300～500rpm條件下提取蛋白1～12h后，在4～25℃下8000～10000g離心15～30min取上清液，調節上清液pH至3.5～4.5沉淀蛋白，蛋白沉淀用水洗2～3次，加水混合調pH至中性后，置于-80℃超低溫冰箱中預凍2～6h，在-55～-45℃、壓力0.03～0.2mBar下凍干24～72h即得粗蛋白，4℃保存備用；

（2）制備質量百分比3～6%的粗蛋白水溶液，在溶液中添加蛋白酶，在30～70℃、pH2.0～9.0下酶解1～4h后，100℃煮沸5～10min滅酶，在4～25℃下，8000～10000g離心10～30min取上清液，對上清液進行抗菌活性測定，取活性好的上清液用截留分子量為5KDa的超濾膜進行分離，收集濾液即得到分子量在5KDa以下的粗蛋白酶解抗真菌抗菌肽溶液，凍干即得抗真菌混合肽粉末，-20℃保存備用；

（3）將磷脂酰膽堿與麥角固醇以質量比1～3:1的比例溶于無水乙醚中，冰浴間歇超聲10～50min使溶液均一，加入直徑為50～100nm的磁性Fe₃O₄，4～10℃輕微振結合20～80min后旋轉蒸發除去溶劑，通入氮氣10～50min除凈乙醚即為磁性真菌細胞膜脂質體；

（4）將步驟（2）抗真菌混合肽粉末配置成濃度5～20mg/mL的肽溶液，與步驟（3）的磁性真菌細胞膜脂質體混合置于離心管中分散，在20～37℃下震蕩孵育20～60min，磁分離架將分散的磁性真菌細胞膜脂質體聚集，溶液即為抗真菌混合肽結合真菌細胞膜脂質體液；

（5）利用高效液相技術檢測抗真菌混合肽結合真菌細胞膜脂質體液和抗真菌混合肽液的指紋圖譜，收集兩者在相同保留時間峰形或峰面積變化的差異峰，該差異峰抗菌肽即為抗真菌活性抗菌肽。

所述步驟（2）中的蛋白酶為風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種，蛋白酶的添加量為2000～10000U/g蛋白。

本發明的優點：