[發明專利]一種高效擴增CIK的方法

有效

• 申請號: 201510618219.2
• 申請日: 2015-09-23
• 公開（公告）號: CN105087487B
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 陳曉波;洪敬欣;韓洪起;韓俊領;武文杰;靳霞;蘇相相;郝世凱;張宇光;王雪蓮
• 申請（專利權）人: 協和干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

本發明公開了一種高效擴增CIK的方法，特別是體外利用細胞因子高效誘導外周血單個核細胞表達CD3及CD56的具有殺傷功能的細胞群,即細胞因子誘導的殺傷細胞。所述高效表達CD3+CD56的CIK培養方法包括以下步驟：無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，在CIK細胞誘導過程中，加入CD3單克隆抗體(CD3mAb)、CD28單克隆抗體(CD28mAb)、干擾素?γ(IFN?γ)、白介素?2(IL?2)、白介素1α(IL?1α)，培養13?16天收獲細胞，制備CIK細胞制劑，并進行流式細胞學檢測和微生物學檢測。本發明提供的CIK培養方法可以在兩周的時間內將CIK數量提高到6×10⁹以上、細胞成活率99％以上，其中CD3+CD56+細胞的雙陽性比例達到30％以上。

技術領域

本發明屬于細胞治療領域，尤其是涉及一種高效擴增CIK的方法。

背景技術

近年來，腫瘤的發生率和死亡率在我國逐年上升，據《2012年中國腫瘤登記年報》顯示，我國每年新發癌癥病例約350萬，因癌癥死亡人數約250萬，全國每天有8550人成為癌癥患者，且癌癥發病成年輕化趨勢。過繼性免疫細胞治療是一種腫瘤康復醫學中新興的、具有顯著療效的全新抗腫瘤治療方法，是繼手術、放療、化療三大傳統治療方法后的另一種治療手段，最大的優勢在于它的個體性、安全性、靶向性和高效性。

細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)屬于免疫細胞治療的一種，最早是由美國斯坦福大學生物學專家于1991年首次報道，他們發現在多種細胞因子(IFN-γ、CD3單克隆抗體、IL-1和IL-2)作用下，外周血淋巴細胞可以被定向誘導并大量增殖成為腫瘤殺傷細胞。由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子,因此具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷細胞的非MHC限制性殺瘤的優點。CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感、對正常骨髓造血前體細胞細胞毒性小等特點，是目前發現的殺傷腫瘤細胞活性強，適合臨床應用的一種理想的效應細胞，但這種效應細胞在正常外周血中極其少見，僅為1％～5％。由此可見，就免疫細胞治療來說，如何獲得足夠數量的、免疫活性強的效應細胞是保證治療效果的必備條件。

CIK細胞能通過體外誘導而大量增殖，常規的CIK制備方法是將分離的外周血單個核細胞加入培養液中，通過添加CD3單克隆抗體(CD3mAb)、IFN-γ、IL-2等相關細胞生長因子進行刺激誘導，最終獲得一定數量的CIK細胞，但最終獲得的CIK細胞的細胞毒活性和增殖倍數都不夠理想。上述細胞生長因子中，CD3mAb促進CIK細胞中T細胞活化和增殖，IFN-γ具有上調外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應的敏感度和強度；IL-2通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結合而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態。

發明內容

本發明的目的旨在針對現有方法所得CIK細胞存在增殖倍數低、CD3+CD56+雙陽表達率不高等問題，提供一種高效擴增CIK的方法，可明顯提高CIK細胞增殖倍數和細胞毒活性，擴增細胞倍數達1000倍以上，CD3+CD56+雙陽表達率大于30％。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種高效擴增CIK的方法，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，在CIK細胞誘導過程中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-1α，培養13-16天收獲細胞，制備CIK細胞制劑。

具體說，包括以下步驟：

(1)采集正常健康人或腫瘤患者外周血，經檢測無污染后，等體積生理鹽水稀釋，利用Ficoll淋巴細胞分離液將稀釋外周血進行單個核細胞分離；分離得到的PBMC用無血清培養基調整濃度至5×10⁵個/ml-9×10⁵個/ml，制成PBMC細胞懸液；