[發明專利]牙鲆神經肽及其應用

有效

• 申請號: 201510612796.0
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105198978B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 張全啟;宋華玉;趙海濤;李贊;王旭波;齊潔;王志剛;于海洋;賀艷
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/17;A61P15/00;A23K20/147;A23K50/80;C12R1/19
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明的目的是提供一種牙鲆神經肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1；本發明克隆得到牙鲆神經肽的編碼序列，并建立和篩選出能有效地進行神經肽重組表達的載體及工程菌，實現了牙鲆神經肽在原核生物體內的融合表達，與傳統的多肽合成方法及從天然資源提取多肽的方法相比，本發明的制備方法使得神經肽大批量、低成本的規模化生產成為可能。本發明得到的工程菌可以直接作為飼料添加劑使用，并利用魚類自身的腸激酶作用釋放神經肽發揮其功能，因此可應用于海洋養殖魚類、養殖禽畜類的飼料添加劑和獸藥，解決了養殖業長期存在的難以安全有效地人工控制養殖品種性成熟過程的問題，并以高科技帶動了養殖業及養殖飼料工業的行業技術進步。

技術領域

本發明屬于蛋白表達應用技術領域，具體涉及一種牙鲆神經肽及其應用。

背景技術

脊椎動物青春期的完成以生殖能力的獲得為標志，而青春期的啟動始于下丘腦脈沖性促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌的提高。在魚類中性腺的發育和成熟受到了下丘腦-垂體-性腺軸中各種性激素信號的嚴格控制。作為該軸的關鍵因子，GnRH通過刺激促性腺激素(促黃體激素(LH)和卵泡雌激素(FSH))的合成和釋放刺激性腺進行配子發生以及類固醇的合成，完成機體性成熟。

自2001年以來，越來越多的研究表明Kisspeptin/GPR54系統是調節下丘腦GnRH釋放的重要信號。Kisspeptin是一種由kiss基因編碼的神經肽類激素，在哺乳動物中可以以成熟的內源性片段kisspeptin54，kisspeptin14，kisspeptin13，kisspeptin10等形式存在并發揮作用。大量研究表明在脊椎動物，包括人、哺乳動物和鳥類中，外源性的kisspeptin刺激會促進GnRH的釋放。王海蓮等人用kisspeptin對雌性大鼠進行皮下注射，結果表明注射能在明顯提前青春期的發生的同時促進各項指標明顯上升。在禽類中，倪迎冬等人用kisspeptin注射蛋雞種蛋則明顯提高蛋雞的出產蛋率以及公雞的性成熟提前。但是這些研究中用到的kisspeptin多是經過公司化學合成的kisspeptin10短肽，并且在C末端進行了酰胺化的蛋白修飾。在使用該神經肽進行動物實驗時，多采用逐個個體注射的方法。這對于在群體數量較大的魚類養殖中進行則可操作性難度較大。目前的報道中還沒有過對神經肽進行體外表達并得到有生物活性的神經肽的案例。因此，如何經濟、大量地獲得功能性的kisspeptin神經肽，如何方便地在水產養殖過程使用該神經肽進行人工控制性成熟將具有重要的意義。

魚類的性腺發育是外部環境和內部神經、內分泌系統協調作用的結果，但養殖條件下，往往缺少自然狀態下環境因子的誘導。Ynoathna等(2001)曾報道幾乎所有的養殖魚類都呈現出一些生殖障礙，如雌魚不能達到卵母細胞最后成熟、排卵和產卵，雄魚精液少，粘稠且質量低，究其原因乃是養殖環境條件變化使養殖魚類性腺的發育受阻。在這種情況下運用魚自身生理過程的啟動因子對性腺發育進行調控則具有良好的可行性。而且在養殖條件下，多數魚類的性成熟需要經歷較長時間，在這種情況下人工縮短性成熟所需要的時間對于節約生產成本、增加經濟效益而言具有重要的意義，同時實現對于養殖魚類的性腺發育控制具有重要的科研意義。

原核表達系統具有培養體系簡單、周期短、發酵成本低廉等優點，因此常被用來進行工程菌株的構建。但是原核表達過程中也經常會遇到表達的蛋白不具備生物學活性的情況，特別是像一些短肽，在原核表達體系中和標簽蛋白形成融合蛋白，標簽蛋白的存在可能會導致短肽被包裹而無法發揮其活性的情況。因此一直以來都鮮有對內分泌神經短肽進行體外表達的成功報道。因此，如何通過基因功能技術生產出能產生具有活性、有功能的神經肽工程菌，并通過簡單的方式作用，對于水產養殖業以及各種禽畜動物飼養將具有廣闊的前景和生產意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種牙鲆神經肽，即能在體外重組表達的，有生物活性的小片段神經肽，及其在控制魚類性腺發育過程中的應用。

本發明首先提供一種牙鲆神經肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1；