[發明專利]一種大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA提取方法

在審

• 申請號: 201510594059.2
• 申請日: 2015-09-17
• 公開（公告）號: CN105154433A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 宋潔;許艷麗;姚欽
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明屬于核酸提取技術，具體涉及一種大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA提取方法。

背景技術

大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)是一種土傳專性寄生線蟲，屬于異皮線蟲屬，由于形成胞囊的原因，有時也可稱為胞囊線蟲屬，為大豆胞囊線蟲病的主要病原，是大豆生產中一種常見的病害，同時也是大豆生產中的主要限制因子之一。大豆胞囊線蟲病的防治方法主要有種植抗性品種、合理輪作、化學防治和生物防治等措施。而目前由于人們環保意識的提高，生物防治逐漸成為研究熱點，利用自然界中大豆胞囊線蟲自身天敵微生物防治該病害已經成為當今線蟲學研究的新動向和新趨勢。

目前世界上已報道的分離自大豆胞囊線蟲各蟲態上的真菌已達到125個屬280余種。從胞囊上分離到的真菌主要包括：厚垣輪枝菌(又稱厚孢普可尼亞菌Pochoniachlamydosporium)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)、被毛孢(Hirsutellaspp.)、鐮孢菌(Fusariumspp.)、粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)、腐枝霉屬(Humicolasp.)、被毛枝葡萄孢(Botryotrichumpiluliferum)、透明毛殼菌(Chaetomiumperlucidum)、高大毛殼菌(C.elatum)、芽枝孢(Cladosporiumcladosporiodes)、雅致小克銀漢霉、(Cunnighamellaelegans)、刺孢小克銀漢霉(C.echinulata)、變異擬青霉(P.variotii)、根異莖點霉(Paraphomaradicina)和異矛束孢菌(Doratomycesheterosporium)等。這些大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌都是生物防治的重要資源。其中很多真菌都對大豆胞囊線蟲能夠產生很好的生防作用。

但是目前對于這些寄生真菌的研究都還主要集中在采用傳統技術進行分離，具體方法是將經過表面消毒后的胞囊直接置于真菌培養基平板上進行真菌分離，并計算相應的分離頻率。這種方法對于一些難于培養的寄生菌很難分離得到，所測結果會產生較大誤差，因此很難準確提供出有關寄生菌群落結構和多樣性信息，并且在DNA提取過程中有損失，胞囊用量大，提取時間長。

發明內容

本發明是要解決目前大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌的DNA提取過程中有損失，難準確提供出有關寄生菌群落結構和多樣性信息，且胞囊用量大，提取時間長的問題，而提供一種大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA提取方法。

大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA提取方法，按以下步驟進行：

一、取100～150個新鮮的大豆胞囊線蟲胞囊，用NaClO進行表面消毒，然后裝入到已經滅菌的2mL離心管中，4℃條件下用滅菌去離子水浸泡18～24h，獲得胞囊樣品；

二、用土壤DNA抽提試劑盒進行胞囊樣品的DNA提取，具體操作參照土壤DNA抽提試劑盒的使用說明書，即完成大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA提取；

其中步驟一中大豆胞囊線蟲胞囊的寄生率為50％以上。

本發明的優點：

利用現有的土壤DNA抽提試劑盒(E.Z.N.A.SoilDNAKit,OmegaBiotek,Inc.,USA)提取大豆胞囊線蟲胞囊寄生菌DNA。該方法所需胞囊量少、步驟簡單、容易操作，使用方便，DNA提取快速準確高效，便于推廣應用。所提取的DNA可用于變性梯度凝膠電泳等微生物多樣性分析，也可用于同類寄生微生物DNA的提取，能夠更全面的了解胞囊寄生菌多樣性及其種類，解決了難于培養微生物無法鑒定的問題。對進一步研究寄生菌對大豆胞囊線蟲作用機理具有一定的推動作用。

本發明中提取DNA所需胞囊用量根據寄生菌寄生情況而定，如果胞囊寄生菌寄生率較低可適當提高胞囊用量，來獲得更高濃度的DNA含量。

附圖說明

圖1是實施例中提取到的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果的電泳圖，其中M為Marker，1-3泳道為大豆22年連作田間土壤中胞囊寄生菌DNA，4-6泳道為大豆3年連作田土壤中間胞囊寄生菌DNA，7-9泳道為小麥-玉米-大豆輪作田間土壤中胞囊寄生菌DNA；

圖2是實施例中提取到的DNA進行DGGE多樣性分析的電泳圖，1-3泳道為大豆22年連作田間土壤中胞囊寄生菌，4-6泳道為大豆3年連作田間土壤中胞囊寄生菌，7-9泳道為小麥-玉米-大豆輪作田間土壤中胞囊寄生菌。

具體實施方式