[發(fā)明專利]一種同時高效提取RNA和DNA的方法及試劑

在審

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• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105087549A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李純錦;周虛;陳璐;陳樹雄;蔣彥文;高珊;趙云;劉卓;李洪蛟
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種同時高效提取RNA和DNA的方法及試劑。

背景技術(shù)

在生物及生物技術(shù)的研究和應用中，RNA的提取已經(jīng)成為重要的基本實驗技術(shù)。盡管已經(jīng)建立了多種提取方法，但對于特定的材料和不同的實驗室，需要從材料、可利用的試劑及基金等方面考慮從而做出不同的選擇。此外，提取的RNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)的研究結(jié)果。

通常采用異硫氰酸胍、鹽酸胍、飽和酚等強變性劑來提取細胞或組織的總RNA。異硫氰酸胍和鹽酸胍都是強烈的蛋白變性劑，不僅能有效解離核蛋白和核酸的復合體，還能強烈抑制RNA酶的活性，并且與加入的β-巰基乙醇共同對RNase產(chǎn)生強烈的抑制作用。這種方法的優(yōu)點在于用了強烈的蛋白變性劑，對細胞本身和提取液中的RNase的活性有非常好的抑制效果。

為了提高RNA提取的效率，GIBCOBRL公司提出了“硫氰酸胍-酚-氯仿”抽提法，即TRIZOL法。TRIzol主要成份是異硫氰酸胍，它可以破壞細胞使RNA釋放出來的同時，保護RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產(chǎn)量十分有用。無論是人、動物、植物還是細菌組織，TRIzol法對少量的組織(50-100mg)和細胞(5×10⁶)以及大量的組織(≥1g)和細胞(>10⁷)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA印跡分析、斑點雜交、poly(A)+選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。TRIZOL試劑能使不同種屬不同分子量大小的多種RNA析出。因此，TRIZOL法的特點是快速，高效，獲得RNA濃度高、純度高，不需要超速離心或多步酚-氯仿抽提。

以上兩種方法雖然均能較好的提取大部分組織和細胞中的總RNA，但是，由于準備試劑種類多，操作步驟多，耗時長，一般提取一次需花費2小時左右，并且由于操作手法問題，會造成不同批次RNA提取的質(zhì)量或濃度相差過大，且RNA質(zhì)量很容易受環(huán)境中RNAse的破壞。

為了簡化RNA提取方法，提高提取效率，目前市面上也有一些組裝開發(fā)的試劑盒。Invitrogen公司的RNAMiniKit，利用快速脫鹽法去除污染的大分子物質(zhì)，能從大量樣本中純化出總RNA；Promega公司的TotalRNAIsolationSystem，采用離心或抽濾技術(shù)，用高濃度的亞硫氰胍稀釋細胞，使RNA酶失活，并選擇性的沉淀胞內(nèi)蛋白，可從組織，細胞，細菌和血液中直接提取RNA，具有高效，快速的特點；Qiagen公司的RNAIsolationMiniKit含RNA穩(wěn)定劑，使RNA保持原有的表達模式，應用硅膠膜技術(shù)和柱式離心技術(shù)，用RNase-FreeDNaseset，在分離RNA的過程中直接在純化離心柱上消化DNA，最后洗脫得到純凈的RNA，該試劑盒步驟簡單，無需酚-氯仿抽提，也不用進行繁瑣的RNA沉淀，且RNA產(chǎn)物中不含5SrRNA，tRNA或其他低分子量RNA；Ambion公司的RNAwizTMKit利用一步法提取，可在1h內(nèi)完成，并可大量提取RNA；上海生工的TRIZOL總RNA抽提試劑盒(UNIQ-10柱式)，利用柱式離心技術(shù)，可從組織，細菌和細胞中提取200個堿基以上的總RNA；北京天根的RNApreppureCellKit利用高效、專一結(jié)合核酸的離心吸附柱和獨特的緩沖系統(tǒng)，從培養(yǎng)細胞或細菌中分離純化高質(zhì)量的總RNA。使用試劑盒提取細菌總RNA主要有以下優(yōu)點：速度快，一般不超過1h；提取試劑中一般含有抑制RNA酶活性的成分，能較好的防止RNA降解，得到的RNA純度和濃度較高。試劑盒提取雖然效率高，獲得的RNA質(zhì)量高，并且能同時處理大量樣本，但是價格較高，一般通用型的50次總RNA提取試劑盒價格為1000元左右，如果是國外品牌價格會在這個基礎(chǔ)上高出2-3倍。尤其在需要大量長期提取樣本RNA時，花費過大，不能普遍適用于廣大的實驗室。

針對以上缺點，研發(fā)一種快速、高效、廉價的RNA提取方法及試劑具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容