[發明專利]基因miR408和UCL在培育高產水稻中的應用

有效

• 申請號: 201510588379.7
• 申請日: 2015-09-16
• 公開（公告）號: CN105112422B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 張金平;李權峰;張玉嬋;于洋;馮彥釗;陳月琴
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.UCL基因在培育高產水稻中的應用，其特征在于，所述基因UCL的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；應用的方法是沉默水稻中UCL基因的表達制備高產水稻；沉默水稻中UCL基因的表達的方法是利用RNA干涉或CRISPR敲除的方法沉默水稻中UCL基因的表達；

所述RNA干涉的方法步驟如下：

S1.構建UCL-RNA干涉質粒；

S11.利用pCAMBIA1305.2、pUC18-Pubi和pZEro-T改造得到RNA干涉載體；

S12.以野生型水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物克隆UCL基因，并且在擴增產物兩端加上HindIII和BamhI的酶切位點；

S13.利用HindIII和BamhI雙酶切步驟S11和S12的產物，然后將兩個雙酶切產物用T4連接酶連接起來，即構建得到中間重組質粒；

S14.用兩端加有MluI和Pst I酶切位點的RNA干涉載體特異引物將克隆的片段從中間重組質粒中再次擴增出，再經MluI和Pst I雙酶切后克隆到同樣酶雙酶切的中間重組質粒中，構建得到UCL-RNA干涉質粒；

S2.UCL-RNA干涉質粒轉化水稻愈傷組織；

S3.轉基因水稻陽性愈傷組織的篩選與分化，得到UCL-RNA干涉水稻突變株；

其中，所述RNA干涉載體特異引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

所述CRISPR敲除的方法步驟如下：

S1.構建UCL-CRISPR敲除質粒；

S11.確定miR408靶基因UCL的兩個打靶位點T1和T2，在T1接頭正向引物5’端加上GCCA四個堿基，在T2接頭正向引物5’端加上GCCG四個堿基，T1接頭反向引物和T2接頭反向引物的5’端均加上AAAC四個堿基；

S12.將每個靶點的正反向接頭引物進行退火形成雙鏈，然后分別連接到BsaI酶切后的pYLsgRNA-OsU3和pYLsgRNA-OsU6質粒片段上，產生兩個sgRNA表達盒；

sgRNA表達盒經兩輪巢式PCR反應擴增，第一輪分別用U-F/接頭反向引物和接頭正向引物/gRNA-R分兩個反應進行，第二輪用位置特異引物PT1-F/PT1-R和PT2L-F/PT2L-R分別擴增T1和T2 sgRNA表達盒；

S13.對兩個sgRNA表達盒的擴增產物進行純化，并進行BsaI酶切，然后用T4連接酶將酶切產物與相同酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體連接起來，即構建成靶向UCL基因的兩個位點的UCL-CRISPR敲除質粒；

S2.UCL-CRISPR敲除質粒轉化水稻愈傷組織；

S3.轉基因水稻陽性愈傷組織的篩選與分化，得到UCL-CRISPR敲除水稻突變株；

其中，所述T1接頭正向引物、T1接頭反向引物、T2接頭正向引物、T2接頭反向引物分別如SEQ ID NO.9～12所示；

所述U-F/接頭反向引物和接頭正向引物/gRNA-R分別如SEQ ID NO.13～14所示；

所述引物PT1-F和PT1-R，PT2L-F和PT2L-R分別如SEQ ID NO.15～18所示。