[發明專利]轉基因玉米MON810雙重數字PCR熒光定量檢測方法

在審

• 申請號: 201510587904.3
• 申請日: 2015-09-15
• 公開（公告）號: CN105112539A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 付偉;朱鵬宇;杜智欣;王晨光;魏霜;張亮亮;彭萱子;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體地說，涉及轉基因玉米MON810雙重數字PCR熒光定量檢測方法。

背景技術

自1996年首例轉基因番茄在美國成功商業化以來，對于轉基因作物的研究近二十年來取得了迅速的發展。根據ISAAA統計數據，截至2014年，全球轉基因作物的種植面積已經達到1.8億公頃，比1996年種植面積提高了近100倍，占全球作物種植總面積的3.4％。轉基因作物的快速發展不僅為現代農業提供了更加便利的育種方式，也由于其未知的安全隱患引起了各個國家和地區的廣泛關注。為此，各國家和地區紛紛建立起轉基因成分的標識制度。在全球各國家和地區制定的轉基因成分標識制度中，定量標識制度占據較大比重，其中以歐盟和日韓最具代表性。我國在轉基因成分標識方面主要采取定性標識制度，由于定性標識制度與定量標識制度在檢測技術等方面存在不同，使我國在作物進出口方面容易受到國際標準的制約。為此，我國需要大力發展轉基因成分定量檢測技術并建立相關定量標識制度。

數字PCR(Digital-PCR)是一種新型的絕對定量PCR檢測方法，是一項檢測和定量核酸的新技術，其基本原理是通過將微量樣品進行大倍數稀釋和分液，直至每個樣品中所含有的待測分子數不超過1個，再將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，有PCR擴增熒光信號記為1，無熒光信號記為0，有熒光信號的反應單元中至少包含一個拷貝的目標分子，針對反應結果采用泊松分布(Poissondistribution)公式，便可計算出樣本的最初拷貝數或濃度。該技術不依賴于擴增曲線的循環閾值，也無需看家基因和標準曲線，即可實現DNA絕對定量。該技術在基因拷貝數變化分析(copynumbervariation,CNV)(Qinetal.,2008)、遺傳突變檢測(Yungetal.,2009)、基因分型(Loetal.，2007)、基因定量(Warrenetal.，2010)、單細胞基因表達(Guoetal.,2010)等方面的研究取得了突破性的發展，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測提供了新的診斷方法。在轉基因檢測方面，Corbisier等(2010)利用數字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內參基因的拷貝數之比，該結果與利用普通熒光定量PCR技術以質粒DNA為標準物質檢測的結果相同，證明了數字PCR的可靠性。Burns等(2010)評估了數字PCR在轉基因檢測中檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了數字PCR在轉基因檢測方面的可行性和反應條件，表明數字PCR能夠對起始模板拷貝數進行絕對定量。然而利用數字PCR對轉基因檢測的研究還處于起步階段。現有數字PCR檢測方法都需要經過樣品前處理過程，在實際檢測中，前處理過程往往會導致實驗結果產生偏差。因此現有的數字PCR檢測方法不適合直接作為轉基因成分的檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種不需要進行樣品前處理步驟的，針對轉基因玉米MON810的雙重數字PCR熒光定量檢測方法，可實現對轉基因玉米品系MON810的絕對定量。

為了實現本發明目的，本發明首先提供用于轉基因玉米MON810雙重數字PCR熒光定量檢測的引物和探針組合，所述引物和探針組合為：

外源基因正向引物：5'-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3'

外源基因反向引物：5'-GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3'

外源基因探針：5'-FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-BHQ1-3'

內參基因hmga正向引物：5'-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'

內參基因hmga反向引物：5'-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3'

內參基因hmga探針：5'-VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。

本發明還提供含有所述引物和探針組合的轉基因玉米MON810數字PCR雙重熒光定量檢測試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、標準陽性模板等中的至少一種。

本發明進一步提供轉基因玉米MON810雙重數字PCR熒光定量檢測方法，所述方法包括以下步驟：

1)提取待測樣品的基因組DNA；

2)以提取的基因組DNA為模板，利用所述的引物和探針組合，進行數字PCR擴增反應；

3)檢測PCR擴增產物。