[發(fā)明專利]人扁桃體上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510583200.9
• 申請日: 2015-09-14
• 公開（公告）號: CN105936888B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金玉;李樹珍;李琦;孫真真;鄭必霞;黃群;楊光
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;G01N33/68
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人扁桃體上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

扁桃體既是周圍淋巴器官，又屬于粘膜相關(guān)淋巴組織，具有復(fù)雜而特殊的隱窩管道系統(tǒng)，位于消化道和呼吸道共同入口處，是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所，其中隱窩上皮是該器官中最先接觸抗原，潴留抗原，并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的位置，因此隱窩上皮是扁桃體行使免疫功能的重要組織屏障。然而在外界抗原的反復(fù)刺激下，常常引起慢性扁桃體炎和腺樣體肥大的發(fā)生，其主要原因就是細(xì)菌和病毒的感染，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)與EB病毒的感染，關(guān)系最為密切。但具體感染機(jī)制尚不明確，因此體外分離人扁桃體隱窩上皮細(xì)胞，能夠更好的進(jìn)一步探討EB病毒的感染機(jī)制。

關(guān)于扁桃體上皮細(xì)胞的原代分離，國內(nèi)尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，國外報(bào)道的扁桃體細(xì)胞分離方法主要集中在兩種分離方法上，最早的一種方法是源于1990年華盛頓大學(xué)口腔生物系和藥學(xué)系的研究，是關(guān)于口腔上皮細(xì)胞的無血清培養(yǎng)技術(shù)，屬于酶消化法，成為后續(xù)扁桃體體外培養(yǎng)的很好的借鑒依據(jù)，但是各實(shí)驗(yàn)室的研究方法技術(shù)上存在一些差異而且不容易成功復(fù)制^[1]。另一種方法是2004年波士頓的塔夫茨大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究，利用新鮮扁桃體的外植體，進(jìn)行體外細(xì)胞遷移，并進(jìn)行培養(yǎng)，但是此種方法，過程較為繁瑣，分離周期較長，受個(gè)體差異影響較大，且容易污染^[2]。

1.Dolphine Oda,E.W.,Human oral epithelial cell culture I.Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium.IN VITRO CELL DEV-AN,1990.26(6):p.589-595.

2.Pegtel,D.M.,J.Middeldorp,and D.A.Thorley-Lawson,Epstein-Barr virus infection in ex vivo tonsil epithelial cell cultures of asymptomatic carriers.J Virol,2004.78(22):p.12613-24..

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是對口腔上皮細(xì)胞的分離技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，探討出了一種成功率較高、步驟簡單、純化率高的，幾乎不會(huì)出現(xiàn)污染的扁桃體上皮細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)技術(shù)，對后續(xù)EB及其它病毒在扁桃體中的作用機(jī)制研究具有重要意義。

為達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：人扁桃體上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法，其步驟如下：

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

(1)培養(yǎng)液配制：采用K-SFM培養(yǎng)基，加入表皮生長因子、牛垂體提取物、CaCl₂、青霉素-鏈霉素混合液和兩性霉素，混勻，過濾，保存；

(2)培養(yǎng)瓶處理；向培養(yǎng)瓶中加入Type I/III膠原，以沒過培養(yǎng)瓶底部為宜，在生物安全柜中避光通風(fēng)過夜，次日紫外燈下照射，保存?zhèn)溆茫?!-- SIPO -->

二、分離培養(yǎng)

(1)扁桃體組織取材：在生物安全柜下將扁桃體組織置于盛有PBS平衡鹽溶液的冰浴培養(yǎng)皿中，去除周邊結(jié)締組織，用滅菌后的PBS清洗數(shù)次，剪成組織塊，并將其轉(zhuǎn)移至dispase grade II溶液中；

(2)扁桃體組織分組消化：孵育過夜；

(3)扁桃體上皮細(xì)胞的分離：將消化好的組織塊，于次日經(jīng)細(xì)胞篩過濾，細(xì)胞懸液離心、棄上清，細(xì)胞沉淀用胰酶消化液重懸、消化；然后加入含有血清的K-SFM培養(yǎng)基，中止消化，再離心、棄上清，最后用K-SFM培養(yǎng)基重懸，將原代細(xì)胞種入培養(yǎng)皿中，靜置培養(yǎng)；

(4)形態(tài)學(xué)觀察：將不同培養(yǎng)時(shí)間的扁桃體上皮細(xì)胞于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)行比較；

(5)免疫熒光鑒定：免疫熒光鑒定包括細(xì)胞角蛋白13(CK13)和細(xì)胞角蛋白8(CK8)的鑒定：待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度達(dá)到70％-90％，棄去培養(yǎng)液，加入固定液固定，棄去固定液后用Triton X-100通透化處理，然后用BSA封閉；加入一抗，過夜；加入熒光標(biāo)記的二抗，后續(xù)步驟均需避光操作，室溫孵育，然后用DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察。