[發(fā)明專利]一種檢測(cè)人類COX-2基因多態(tài)性的試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510581649.1
• 申請(qǐng)日: 2015-09-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105671036A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐運(yùn);邵淵;張希根
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京仁天生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司 32226
• 代理人: 孫鷗;朱杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測(cè)技術(shù)中的基因檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種檢 測(cè)人類COX-2基因多態(tài)性的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

環(huán)氧化物水解酶(cyclo-oxygen-ase，COX)，是前列腺素(PGs)合成所必須的 酶，也是PGs合成初始步驟中的關(guān)鍵性限速酶。COX有兩種同工酶COX-1和COX-2。 人體COX-2基因定位于染色體的1q25.2～q25.3區(qū)，長(zhǎng)度約8.3kb，包含10個(gè)外 顯子和9個(gè)內(nèi)含子，共編碼604個(gè)氨基酸。在5′端轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游有一些轉(zhuǎn)錄調(diào) 控序列，包括2個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)位點(diǎn)、2 個(gè)激活蛋白質(zhì)-(2activatorportein-2，AP-2)位點(diǎn)、TATAbox序列、cAMP 反應(yīng)元件(cAMPresponsiveelement，CRE)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白位點(diǎn) (CCAAT/enhancerbindingprotein，C/EBP)、Ets-1轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)等。COX-2 幾乎在所有組織中有表達(dá)，主要分布于細(xì)胞核膜上，其表達(dá)調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄 水平。誘導(dǎo)其表達(dá)的因素包括癌基因、白細(xì)胞介素-1、缺氧、紫外線、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)等，而地塞米 松、抗氧化劑、抑癌蛋白P53等則可抑制其表達(dá)。因此，COX-2基因多態(tài)性改變 可能潛在地影響某種因子的結(jié)合，改變基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響環(huán)氧化酶的表 達(dá)。通過(guò)對(duì)COX-2基因多態(tài)性的檢測(cè)可為個(gè)體對(duì)某些疾病(如癌癥等)的易感性 診斷提供幫助

在本發(fā)明作出之前，目前進(jìn)行基因突變檢測(cè)的方法有數(shù)十種。金標(biāo)準(zhǔn)法為基 因測(cè)序法。基因測(cè)序法是目前應(yīng)用最廣泛、較準(zhǔn)確的一種方法，但是該方法需要 昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的人員進(jìn)行操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在臨床上很難進(jìn)行推廣。基 因芯片法具有快速高通量的優(yōu)點(diǎn)，但是操作上復(fù)雜，步驟多，成本高也不易普及。 以限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)基因突變的方法具有成本低廉的優(yōu)點(diǎn)， 但是過(guò)程煩瑣，時(shí)間長(zhǎng)也不適合普及。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測(cè)人類COX-2基因多態(tài)性的 試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)人類COX-2基因多態(tài)性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內(nèi)的物質(zhì)， 其主要技術(shù)特征在于：所述盒體內(nèi)的物質(zhì)包括檢測(cè)COX-2基因上的rs20417號(hào)SNP 位點(diǎn)的特異性引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl₂溶 液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水；

所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：

正義引物：5’-CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3’，

反義引物：5’-TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3’；

所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：

野生型探針：5’-FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3’

突變型探針：5’-HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3’。

所述盒體中各物質(zhì)的含量為：濃度為10μM的特異性引物共0.45μl，其中 正義引物和反義引物各0.225μl；濃度為5μM的特異性熒光探針共0.2μl，其 中野生型探針和突變型探針各0.1μl；濃度為5單位/μl的TaqDNA聚合酶 0.02μl；濃度為20mM的dNTP混合液0.1μl；濃度為25mM的MgCl2溶液0.5 μl；5X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2μl；去離子水4.73μl。

所述特異性引物中，正義引物的Tm值為58.6℃，反義引物的Tm值為58.5 ℃；所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為67℃，突變型探針的Tm值 為66℃。

所述試劑盒的保存溫度為-20℃。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)人類COX-2基因多態(tài)性的試劑盒的應(yīng)用，其主要技術(shù)物征在于：所 述試劑盒用于檢測(cè)COX-2基因上的rs20417號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)準(zhǔn)確性高、檢測(cè)簡(jiǎn)單方便、檢測(cè)時(shí)間 短、結(jié)果分析簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室使用：