[發(fā)明專利]一種食品中微生物快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510575245.1
• 申請日: 2015-09-10
• 公開（公告）號: CN105203510B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃和;徐晴;王磊;畢建成;賀滄
• 申請（專利權(quán)）人: 鎮(zhèn)江泰和益元生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;楊秀麗

本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，提供一種食品中微生物快速檢測方法及檢測前快速處理裝置。該方法包括(1)食品預(yù)處理；(2)第一次膜過濾(3)第二次膜過濾(4)微生物細(xì)胞裂解?ATP檢測前一體化處理(5)微生物檢測。所述裝置包括：瓶體(1)，與瓶體內(nèi)壁緊密貼合的活塞(2)，活塞桿(3)，第一過濾膜(4)、細(xì)胞裂解?ATP檢測前一體化處理室(6)、第二過濾膜(8)。利用本發(fā)明方法對食品樣品進(jìn)行預(yù)處理，能夠有效消除食品本身對檢測體系的影響。本發(fā)明裝置也提供一種方便、快速、高效的食品中微生物檢測前快速方式，減少操作過程中不必要的步驟，更可以消除食品本身所攜帶的細(xì)胞及游離ATP的影響，提高檢測準(zhǔn)確性，輕巧方便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，涉及一種食品中衛(wèi)生物快速檢測方法及檢測前快速處理裝置。

背景技術(shù)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，食品種類越來越豐富，而新的食品安全問題亦不斷涌現(xiàn)，嚴(yán)重影響了人民群眾的生命安全及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。食品中微生物總數(shù)的檢測是確保食品安全的一個(gè)重要檢測項(xiàng)目。目前我國普遍采用平板菌落計(jì)數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測，從采集樣品，微生物細(xì)胞稀釋、涂布、培養(yǎng)到取得結(jié)果至少需要24-48小時(shí)，因此，難于從生產(chǎn)原料、生產(chǎn)設(shè)備層面、物流、銷售等方面進(jìn)行實(shí)時(shí)有效的監(jiān)測，造成產(chǎn)品質(zhì)量下降、資源浪費(fèi)，食品安全事故頻發(fā)。

所有生物，包括細(xì)菌細(xì)胞在內(nèi)都有數(shù)量相對穩(wěn)定的生物能量物質(zhì)，三磷酸腺苷(ATP)。美國太空總署用熒光素酶檢測月球樣品中是否含有痕跡量ATP，作為月球存在或者有過生命存在的佐證。早在1884年，Dubois發(fā)現(xiàn)將螢火蟲研磨后熒光很快會(huì)消失，添加螢火蟲尾部的新鮮提取物后又能重現(xiàn)熒光。此后，他證實(shí)提取物中存在熒光素和熒光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的條件下，蟲光素酶可催化熒光素氧化并發(fā)出便于靈敏檢測的熒光。且上述反應(yīng)遵循細(xì)胞數(shù)越多，ATP能量越高，熒光值越高的線性比例關(guān)系。上世紀(jì)80年代后，美、英、德、日根據(jù)上述原理先后設(shè)計(jì)生產(chǎn)出各種形式的可付諸使用的細(xì)菌總數(shù)的快速檢測系統(tǒng)系列產(chǎn)品，用于樣品中微生物總數(shù)的測定，在幾分鐘內(nèi)就可獲得結(jié)果，大大縮短了檢測時(shí)間。但所有生物體內(nèi)均含有ATP，包括食品中可能存在的動(dòng)植物細(xì)胞。食品中動(dòng)植物細(xì)胞及可能的游離ATP的存在對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性將會(huì)產(chǎn)生影響，限制了該方法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。所以，ATP方法自二十世紀(jì)80年代問世后，在很長一段時(shí)間內(nèi)只能用于對食品加工環(huán)境、器具或包裝進(jìn)行檢測，不能檢測食品成品本身。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過開發(fā)分級裂解與過濾食品樣品的裝置，消除了食品體系中非微生物細(xì)胞及游離ATP對測定結(jié)果的影響，拓寬了ATP檢測方法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)

1.本發(fā)明提供一種食品中微生物快速檢測方法，該方法包括如下步驟：

(1)食品預(yù)處理：用拭子輕拭樣品表面后，將拭子置于無菌的4.5-5ml 0.1-0.2MpH 7.0-7.4的PBS緩沖液中蕩洗干凈，獲得樣品液；

(2)第一次膜過濾：室溫下，將上述步驟(1)獲得的樣品液通過孔徑為10-20um的過濾膜，得到過濾液1；

(3)第二次膜過濾：室溫下，將上述步驟(2)獲得的過濾液1通過孔徑為0.2～0.5um的過濾膜，截獲膜上微生物細(xì)胞；

(4)微生物細(xì)胞裂解—ATP檢測前一體化處理：將步驟(3)截獲的微生物細(xì)胞通過細(xì)胞裂解與ATP檢測一體化試劑，室溫下反應(yīng)10-15s，獲得樣品處理液；

其中，細(xì)胞裂解與ATP檢測一體化試劑為：1-2％Triton X-100、100-120mmolNaCl、 0.1-0.5％脂肽類表面活性劑、2-2.5ul熒光素酶，0.1-0.15mg/ml熒光素，1-1.5mMDTT， 4.5-5mM MgSO4，20-25mM N-三(羥甲基)甲基甘氨酸，pH 7.8；反應(yīng)量為：每100ul上述一體化試劑加入1.5-2ul樣品液；