[發明專利]一種高質量薏苡基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201510574684.0
• 申請日: 2015-09-11
• 公開（公告）號: CN105087548A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 付瑜華;楊成龍;劉凡值;周明強;李志芳;黎青;班秀文;蒙秋伊;敖茂宏;劉鵬飛;王建;羅凱;周祥
• 申請（專利權）人: 貴州省亞熱帶作物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李余江;程新敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種薏苡基因組DNA提取方法。

背景技術

從植物組織中提取基因組DNA是植物分子生物學研究中的一個基本操作步驟，可應用于文庫構建、Southern雜交、分子標記開發和輔助育種等多個方面。DNA質量好壞直接關系到后續實驗的成敗，經典的基因組DNA提取方法主要為CTAB法和SDS法兩種，但研究發現，由于不同植物葉片中所含次生代謝產物的含量和種類存在差異，導致實驗中適合一種植物基因組DNA提取的方法并不能在另一種植物基因組DNA提取中獲得同樣好的效果，因此，分子生物學科學家們根據不同植物組織的特質和研究目的，開發了適合不用植物組織提取基因組DNA的方法，包括改良的CTAB法和SDS法，CTAB-SDS法、高鹽低pH法和尿素法等，以期獲得產量高、純度好的基因組DNA。

薏苡是我國傳統的藥食兩用植物，其根、葉和果實均可入藥，與目前對薏苡種仁藥理學方面開展了較多的研究相比，薏苡分子生物學研究還處于起步階段，開發一種適合薏苡提取高質量基因組DNA的方法是順利開展薏苡分子生物學研究的基礎。薏苡葉片中生物堿和多糖類物質含量較高，傳統的DNA提取方法獲得的薏苡DNA含有較多雜質，很難滿足包括酶切在內的很多對DNA質量要求較高的實驗需求，因此，現有的薏苡DNA提取方法依然在不足。

發明內容

本發明的目的針對現有技術的不足，提供一種可有效去除雜質，DNA得率和純度都較高的薏苡基因組DNA提取方法。

本發明的技術方案如下：

一種高質量薏苡基因組DNA提取方法，包括如下步驟：取在液氮中充分研磨的薏苡葉片迅速放入提取液中，混勻后置于65℃水浴中30min；冷至室溫后加入0.25倍體積無水乙醇和0.11倍體積的5mmol/LKAc溶液，渦旋混勻；加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合液抽提，低溫離心的離心條件溫度為4℃，離心轉速為12000rpm，離心時間為15min；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合液進行第二次抽提，同樣離心條件進行離心后獲得第二次上清液；將二次離心上清液加入4倍體積CTAB沉淀緩沖液，混勻后室溫靜置1h，然后4℃離心，離心轉速為12000rpm，離心時間為5min；將沉淀溶于400μL1mol/LNaCl溶液中，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，絮狀沉淀析出后用槍頭挑出放于1.5mL離心管中；DNA沉淀用70%乙醇洗滌兩次，風干后溶于500μLTE溶液中。

所述的提取液由如下成分組成：濃度2%CTAB，100mmol/LTris-HCl,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，濃度2%PVP，濃度1%SDS，pH為8.0，提取液使用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%。所述的CTAB沉淀緩沖液由如下成分組成：濃度1%CTAB，100mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA，pH為8.0。所述的TE溶液由如下成分組成：1mmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，pH為8.0。

與現有技術相比，本發明的優點是在將植物組織DNA抽提到提取液中后，添加了無水乙醇和高鹽KAc溶液的步驟，增強了除去生物堿、多糖、多酚類等雜質的效果。另外，通過離心方式獲得第一次DNA沉淀，保證了DNA的得率，將其溶于NaCl溶液后再用無水乙醇進行第二次沉淀，保證了獲得DNA的純度，尤其能滿足需要酶切實驗操作的研究項目。

附圖說明

圖1為薏苡葉片DNA的瓊脂糖電泳圖，圖中，1:markerDL2000;2:傳統CTAB法提取黔薏苡1號嫩葉DNA,3μL;3:改良CTAB法提取黔薏苡1號嫩葉DNA,3μL;4:改良CTAB法提取黔薏苡1號老葉DNA,3μL;5:改良CTAB法提取興仁小白殼嫩葉DNA,3μL;6:改良CTAB法提取興仁小白殼老葉DNA,3μL;7:改良CTAB法提取薏苡新品系嫩葉DNA,3μL。

圖2為薏苡品種黔薏1號DNA酶切結果電泳圖，圖中，1:markerDL2000,2:EcoRI,3:BamHI,4:XhoI,5:DraI,6:marker15000。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。

實施例1：

如圖1和圖2所示，以黔薏1號為原料，按如下步驟實施：

(1)將新鮮或冷凍的的薏苡葉片在液氮中充分研磨，取約100mg加入到0.8mL提取液中，渦旋徹底混勻，于65℃水浴中放置30min。