[發(fā)明專利]一種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510572445.1
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN105039394A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設計）人: 黃鳳蘭;陳永勝;李國瑞;彭木;趙永;李佳會;姜桐桐;孟凡娟;張智勇;趙華洋;陳曉鳳;羅蕊;李躍;孫華軍;邢超
• 申請（專利權）人: 內蒙古民族大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)分離磷脂酶C基因的兩個片段；

(2)構建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表達載體；

(3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表達載體轉化農桿菌；

(4)用農桿菌介導法對蓖麻子葉節(jié)進行遺傳轉化，獲得轉基因抗性植株；

(5)對轉基因抗性植株進行檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步驟(1)中分離磷脂酶C基因的兩個片段的方法，具體步驟如下：

1)用試劑盒法提取蓖麻種子中的總RNA；

2)用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA；

3)用Primer-premier5.0軟件設計引物：據(jù)NCBI中發(fā)布的蓖麻磷脂酶C基因的mRNA序列號XM_002511121.1，利用Primer-premier5.0軟件設計兩對引物，分別命名為C1S與C1X、C2S與C2X，應用DNAMAN軟件分析基因序列內部的限制性酶切位點，并根據(jù)pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121質粒上的多克隆位點的情況，以及引物前端加酶切位點和保護堿基的原則，設計各條引物序列；

4)用降落PCR的方法分離磷脂酶C基因的兩個特異性片段；

5)用膠回收試劑盒回收特異性片段；

6)C1、C2特異性片段分別與pMD18-T-Simple-Vector克隆載體連接；

7)連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞；

8)用PCR和酶切的方法篩選大腸桿菌陽性克隆；

9)大腸桿菌陽性克隆提交生物公司進行序列測序：測序結果表明蓖麻磷脂酶C基因的C1、C2片段堿基長度分別是803bp、458bp。

3.根據(jù)權利要求1所述的獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步驟(2)中用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA的方法，具體步驟如下：

1)用限制性內切酶和膠回收試劑盒從克隆載體上分別酶切、回收磷脂酶C基因兩個特異性片段；

2)用限制性內切酶將內含子從pHANNIBAL載體上切下，用膠回收試劑盒回收；

3)用限制性內切酶將植物表達載體質粒pBI-121線性化；

4)用連接酶將磷脂酶C基因的兩個特異性片段、內含子和pBI-121連接在一起；

5)連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞；

6)用PCR和酶切的方法篩選大腸桿菌陽性克隆：設計的引物上游在pBI-121的35S啟動子上，下游則在內含子和C1片段上，引物分別命名為NS1和NX1、C1S1和C1X1；

7)大腸桿菌陽性克隆提交生物公司進行序列測序：經測序，證明所構建的含有磷脂酶C基因的RNAi植物表達載體pBI-C1-IN-C2結構正確。

4.根據(jù)權利要求1所述的獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步驟(4)獲得轉基因抗性植株的方法，具體步驟如下：

1)蓖麻子葉節(jié)預培養(yǎng)；

2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表達載體質粒的農桿菌浸染蓖麻子葉節(jié)；

3)農桿菌與子葉節(jié)共培養(yǎng)；

4)用除菌劑除去子葉節(jié)上的農桿菌；

5)用卡那霉素對子葉節(jié)進行抗性篩選；

6)轉基因抗性苗進行馴化移栽，得到轉基因抗性植株的種子。

5.根據(jù)權利要求1所述的獲得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步驟(5)中對轉基因抗性植株進行檢測的方法，具體步驟如下：

1)分子檢測包括：DNA水平對轉基因抗性植株葉片采用PCR檢測，RNA水平對種子采用熒光定量PCR檢測，蛋白質水平對種子采用Western-Blot檢測；

2)生物學檢測：測定轉基因抗性植株和對照非轉基因植株種子中蓖麻油酸含量和總蓖麻油含量，步驟包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲醇溶液進行甲酯化；利用氣相色譜-質譜-計算機聯(lián)用技術分離、鑒定蓖麻油酸含量和總蓖麻油含量。