[發(fā)明專利]甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510570664.6
• 申請日: 2015-09-09
• 公開（公告）號: CN105087514A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田紅梅;方凌;嚴(yán)從生;王朋成;王艷;張其安
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/48
• 代理公司: 安徽省蚌埠博源專利商標(biāo)事務(wù)所 34113
• 代理人: 楊晉弘

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從甜瓜葉片提取蔗糖磷酸合成酶以及測定其活性的方法。

背景技術(shù)

蔗糖磷酸合成酶是一種關(guān)鍵的蔗糖代謝酶，也是一種重要的光合酶，其活性與凈光合速率呈正相關(guān)，因此研究該酶活性對于改善甜瓜光合作用具有重要意義。目前蔗糖磷酸合成酶提取大部分采用的是G-25Sephadex柱和透析袋，G-25Sephadex柱價格昂貴，提取成本較高，而透析袋價格較低，但操作繁雜，耗費時間，且提取效率低；離心式去鹽柱價格稍高，但具有可再生性，提取效率優(yōu)于透析袋和G-25Sephadex柱。在酶活性測定方面，目前存在的問題是酶與底物反應(yīng)時間及溫度研究者較少關(guān)注，不同的材料其最佳反應(yīng)條件不一，本發(fā)明優(yōu)化了甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶活性測定條件。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測定方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性測定方法，包括以下步驟：

(1)酶液提取：稱取2g甜瓜新鮮葉片，放入預(yù)冷的研缽中，加10mL提取緩沖液；加入石英砂，冰浴下研磨，充分勻漿后，0～4℃條件下12000rpm離心20min，取上清液，去除初提酶液中的鹽分，純化后的酶液可直接用于酶活性測定；

(2)酶活性測定：以0.2mL酶液沸水浴10min為對照；取0.2mL酶液加入反應(yīng)底物；15～40℃條件下反應(yīng)3～30min；沸水浴1min，用雙蒸水定容至1mL，加入0.1mL2mol·L^-1NaOH，沸水浴10min，流水沖洗冷卻；向反應(yīng)液中加入3.5mL30％HCl，1mL0.1％間苯二酚，搖勻后在80℃水浴鍋中水浴10min，流水冷卻后，480nm比色。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，提取緩沖液由以下組分組成：50mmol·L^-1HEPES[N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2磺酸],1mmol·L^-1EDTA.Na₂，10mmol·L^-1MgCl₂，2.5mmol·L^-1DTT，10mmol·L^-1抗壞血酸；且HEPES提取緩沖液的pH值為7.5。

作為優(yōu)選，步驟(1)中采用離心式去鹽柱去除初提酶液中的鹽分。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，反應(yīng)底物包含0.1mL50mmol·L-¹果糖-6-磷酸，0.1mL30mmol·L^-1UDPG，0.1mL100mmol·L^-1Tris，0.05mL10mmol·L^-1MgCl₂。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，甜瓜葉片蔗糖磷酸合成酶及反應(yīng)底物在30℃水浴中反應(yīng)5min即可達(dá)到最高酶活性。

本發(fā)明的有益效果是：

能夠有效將初提取酶液中的鹽分、糖分、離子等小分子物質(zhì)除去，從而更能夠精確地測定葉片中蔗糖磷酸合成酶的活性。

具體實施方式

(一)實驗方法

1、供試材料：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所自主選育的甜瓜品種“早甜一號”，搜集到的甜瓜變種“羊角蜜”、“S1”。

2、實驗設(shè)計

甜瓜長至三葉一心時取同一部位葉片，將葉片剪碎混勻，每份稱取2g，迅速置于液氮中速凍，然后保存在-80℃冰箱中備用。本試驗分別采用離心式去鹽柱、G-25Sephadex柱和透析袋提取蔗糖磷酸合成酶。每個處理3次重復(fù)。

3、蔗糖磷酸合成酶的提取

將待測樣品放入預(yù)冷的研缽中，加10mL提取緩沖液(50mmol·L^-1HEPES,1mmol·L^-1EDTA.Na₂，10mmol·L^-1MgCl₂，2.5mmol·L^-1DTT，10mmol·L^-1抗壞血酸，pH7.5)；加入石英砂，冰浴下研磨，充分勻漿后，0～4℃條件下12000rpm離心20min，取上清液，取0.5mL上清液慢慢滴入離心式去鹽柱(Spin-OUT^TMGT-1200)，收集到的酶液可直接用于酶活性測定。

4、蔗糖磷酸合成酶活性的測定