[發明專利]一種定量檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法

有效

• 申請號: 201510570111.0
• 申請日: 2015-09-09
• 公開（公告）號: CN105087805B
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 李挺;宋斌;李泰輝;鄧旺秋
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種定量檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法。定量快速檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。定量快速檢測廣東蟲草的核酸分子引物，該核酸分子引物為：FS：5`?GCTCCGATTCGATGGC?3`；RS：5`?TACAGCAGGCAGGTGGC?3`。利用本發明的核酸分子引物FS和RS進行熒光PCR擴增，僅廣東蟲草能夠激發熒光信號，而其他蟲草如冬蟲夏草、蛹蟲草和分枝蟲草均在循環數小于35時均無Ct值，表明了本發明的核酸分子引物FS和RS具有很高的特異性，可以用于快速檢測廣東蟲草(菌絲體和子實體)及其相關制品的真偽和含量。

技術領域：

本發明屬于利用分子生物學方法檢測中藥材真偽的技術領域，具體涉及用于檢測廣東蟲草(Cordyceps guangdongensis)的特征性核苷酸序列以及分子引物和定量檢測廣東蟲草的方法。

背景技術：

廣東蟲草(Cordyceps guangdongensis T.H.Li,Q.Y Lin&B.Song)是2008年在廣東境內發現的特有蟲草新品種。經研究發現，該蟲草安全無毒可食，具有較好的抗氧化活性、抗疲勞和延壽作用等。廣東蟲草的蟲草素和腺苷含量雖比蛹蟲草低、但比冬蟲夏草高，其蟲草酸含量與冬蟲夏草比較接近，具有較好的開發應用價值和市場潛力。2013年國家衛生部批準“廣東蟲草子實體”成為新資源食品，是繼蛹蟲草之后的又一個“蟲草子實體”新資源食品，可作為冬蟲夏草的替代品，緩解了蟲草市場的壓力，也豐富了蟲草市場。因此，研制快速、定量檢測廣東蟲草及其相關制品的真偽及含量技術對廣東蟲草產業的健康發展具有重要的意義，對廣東蟲草的商業化生產與產品檢驗具有實質應用價值。在前期的研究中，專利發明人已申請并獲得了國家發明專利授權的“鑒別廣東蟲草的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法ZL201110212383.5.”，該專利只能對廣東蟲草進行定性檢測，而不能定量檢測。

內參基因(reference genes)是在不同個體及組織細胞中均穩定表達的基因，又叫管家基因(house-keeping gene)，常用的內參基因如微管蛋白(tubulin)，β肌動蛋白(β-actin)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)，18s RNA真核生物核糖體RNA(18s rRNA)等(張玉芳,2014)。在生物學研究中，內參基因主要用于對目的基因定量結果的校正，即需要判定實驗結果是基因本身的表達量的高低，還是操作過程中造成的誤差，所以需要同時檢測內參基因作為參照。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供了能夠用于快速檢測廣東蟲草(菌絲體和子實體)相關制品的真偽以及檢測廣東蟲草含量的廣東蟲草的特征性核苷酸序列。

本發明的定量快速檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，共包含234bp的堿基。該定量快速檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列源于廣東蟲草的α-tubulin蛋白編碼基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共包含1498bp的堿基)。

本發明的第二個目的是提供擴增上述定量快速檢測廣東蟲草的特征性核苷酸序列的核酸分子引物，其特征在于，該核酸分子引物為：

FS：5`-GCTCCGATTCGATGGC-3`；

RS：5`-TACAGCAGGCAGGTGGC-3`。

上述核酸分子引物序列FS和RS的退火溫度相近，均不能形成引物二聚體。該核酸分子引物不與冬蟲夏草、蛹蟲草和分枝蟲草等蟲草起反應，僅與廣東蟲草發生反應而具有極高的特異性。在熒光定量PCR過程中依據熒光信號的強弱來檢測底物中廣東蟲草的含量，且靈敏度高。因此，利用該核酸分子引物通過熒光定量PCR擴增可以快速地對廣東蟲草(菌絲體、子實體)及其相關制品的真偽進行檢測并且能測定其含量。