[發明專利]一種表達PPV VP2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒株

在審

• 申請號: 201510568140.3
• 申請日: 2015-09-09
• 公開（公告）號: CN105368796A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發明（設計）人: 陳紅英;楊明凡;王林青;付朋飛;喬涵;楊興武;李新生
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張紹琳;張真真

技術領域

本發明涉及一種表達PPVVP2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒株。

背景技術

豬細小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，可引起胚胎早期死亡，木乃伊胎，死胎，不孕不育和延遲發情，同時還會引起仔豬皮炎癥狀、非化膿性心肌炎和消瘦性綜合征。并常與豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬圓環病毒等其他病原混合感染而加重了其危害，給養豬業帶來巨大的經濟損失。

豬偽狂犬病毒也是引起豬繁殖障礙的主要病原之一。其危害主要表現為母豬流產，產死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡等綜合征，臨床以產死胎為主。偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)基因組龐大，大小為150kb，含TK、gI、gG、gL等多個非必需基因，具有足夠的空間允許外源基因的穩定插入，其容量可高達40kb，并且重組病毒在增殖的同時可穩定表達外源基因，從而提供對偽狂犬病毒和其它相應傳染病的抵抗力。PRV具有病毒穩定、無致癌性、免疫原性持久，能夠同時激發細胞免疫和體液免疫等優點，具有一個優良活病毒載體的基本特征，因此PRV適合基因工程活載體疫苗的研究和開發，已有多種病原利用PRV病毒載體得到表達。

白細胞介素18(IL-18)能誘導IFN-γ大量分泌表達，促進T細胞增殖及Th1細胞的免疫應答，增強NK細胞的殺傷活性，抑制Th2類細胞因子的生成，具有廣泛的生物學效應，在免疫調節、抗腫瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。IL-18作為一種新發現的天然免疫調節劑，目前已被公認為是一種可以替代傳統療法的新型治療劑和有效的免疫佐劑，已經成為研究熱點。據報道IL-18在豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環病毒2型DNA疫苗、新城疫活疫苗等多種動物疫苗中作為免疫佐劑，起到了一定的免疫增強作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達PPVVP2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，分類命名：表達PPVVP2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒PRV-PPV-IL18PGVP218，拉丁文學名：Herpesviridae。保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱：CCTCC，保藏單位地址：中國武漢武漢大學，保藏日期：2013年11月18日，保藏編號CCTCCNO：V201347。

本發明的技術方案是：一種表達PPVVP2基因和豬IL-18基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，其特征在于：重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCCNO：V201347。

本發明的有益效果是：本發明利用豬偽狂犬病毒作為活病毒載體能夠攜帶外源基因的特點，將豬細小病毒的主要抗原基因VP2基因片段插入豬偽狂犬病毒非必需基因區內，使兩種引起豬繁殖障礙的病原結合在一起，構建能夠同時預防PRV和PPV的重組病毒。同時插入新型細胞因子IL-18作為分子免疫佐劑，以期考察IL-18在重組疫苗中的免疫增強作用效果。為方便篩選重組病毒，需要篩選標記，GFP是一種吸收藍光或紫外光后發出綠色熒光的天然蛋白質，不需要任何外源性底物和輔助因子，無毒、無污染、穩定，被廣泛應用于分子生物學研究，故在構建時插入了綠色熒光蛋白(GFP)基因作為篩選標記。

本發明以PPVHP/104株DNA為模板，PCR擴增PPVVP2蛋白主要抗原基因，連接到18-T載體中，構建了重組質粒pMD-VP2。PCR擴增豬IL-18基因，利用重組技術將豬IL-18基因定向插入到實驗室構建的含部分PRV基因，且帶EGFP篩選標志的PRV轉移質粒pG中，構建重組質粒pG18。從重組質粒pMD-VP2中獲取VP2基因片段，將其定向插入到質粒pG18中，得到重組轉移質粒pG18-VP2。將pG18-VP2與PRV弱毒株DNA共同轉染豬睪丸細胞(ST細胞)，得到能夠表達PPVVP2蛋白和IL-18的重組偽狂犬病毒PGVP218。以小鼠為實驗動物，評價重組病毒的免疫原性，并與不含IL-18的重組病毒免疫效果進行比較。為在生產上同時預防豬細小病毒病和豬偽狂犬病提供新的思路和試驗依據，同時也為探索豬IL-18對重組病毒的免疫增強奠定基礎。