[發明專利]一種棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201510564485.1
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN105177134A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: 姜玉松;徐敬明;樊汶樵;吳寶紅;李曉英
• 申請（專利權）人: 重慶文理學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙) 11316
• 代理人: 劉佳

1.一種檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒，包含2倍反應混合緩沖液、上游引物、下游引物、Taq酶和滅菌的ddH₂O，其特征在于所述上游引物為S-F：5’–AGGTAACGGCGTAAATAG–3’，所述下游引物S-R：5’–ACTTGCTTCAGGACCATA–3’。

2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，所述2倍反應混合緩沖液包含以下成份：

3.如權利要求2所述的檢測試劑盒，所述2倍反應混合緩沖液的量為1.0ml。

4.如權利要求1所述的檢測試劑盒，所述上游引物和下游引物的濃度均為10μM/L。

5.如權利要求1所述的檢測試劑盒，所述Taq酶為5U/μLTaq酶，其用量為0.5μL；所述滅菌的ddH₂O的用量為1.0mL。

6.如權利要求1所述的檢測試劑盒，還包含陽性對照液和陰性對照液。

7.如權利要求1所述的檢測試劑盒，所述陽性對照液為感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的基因組DNA，所述陰性對照液為ddH₂O。

8.一種采用權利要求1-7任一所述的試劑盒檢染棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的方法,包含以下步驟：

(1)棘腹蛙DNA的提?。?/p>

①取病蛙眼、口腔或胃部組織，剪碎后置于勻漿器中，加入勻漿液后冰浴研磨，研磨碎裂后置離心管中；

②加入1％-3％的β-巰基乙醇溶液，混勻后60-70℃水浴0.5-1h，每隔3-5分鐘取出搖勻一次；

③10000-15000rpm離心3-7min，離心后，移出上清液于另一無菌離心管中，棄沉淀；

④向上清液中加入等體積的按體積比20-30：1的氯仿：異戊醇的混合溶劑，混勻后，8000-12000rpm離心5-15min，取上清液至另一無菌離心管中；

⑤加入等體積的氯仿，混勻后8000-12000rpm離心5-15min，再取上清液；

⑥向上清液中加入0.8-1.2倍體積的2-4MNaAc溶液，混勻后再加入1.5-2.5倍體積預冷的無水乙醇，充分混勻后于-18℃以下放置30min以上；

⑦10000-15000rpm離心3-7min，棄上清液，所得DNA沉淀在室溫下晾干；

⑧用70-80％的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，37℃消化20-40min，獲得DNA之后于-20℃保存；

(2)PCR反應體系：采用20μL的PCR反應體系，在0.2mLPCR反應管內分別加入2倍反應混合緩沖液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積20μL，同時分別用陽性對照液和陰性對照液作為模板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數秒，置于PCR反應儀上反應；

(3)PCR反應條件：95℃預變性5分鐘；然后95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循環30次；72℃延伸7分鐘，最后4℃保存；

(4)PCR擴增產物的檢測：PCR反應結束后，取10μL產物放在含溴化乙錠0.5μg/mL的1％瓊脂糖凝膠上，使用0.5×TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產物，檢查PCR產物的預期大小；

(5)結果與判定：在紫外燈下觀察并與標準分子量相對照，若檢測樣品在226bp處出現明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為金黃色葡萄球菌陽性；若陽性對照可見目的條帶，而檢測樣品無目的條帶出現，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的金黃色葡萄球菌。