[發明專利]一種霉菌生產手性苯基二氯乙醇的方法

在審

• 申請號: 201510560652.5
• 申請日: 2015-09-07
• 公開（公告）號: CN105063103A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 候培磊;張媛媛;劉均洪
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到黑霉菌細胞生物催化制備手性醫藥中間體(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇的技術。

背景技術

手性(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環境友好、條件溫和、選擇性高等優點,作為綠色高效制備手性化合物的優先途徑,被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化合物。生物催化制備手性(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇具有很好的應用前景。

生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點,是可持續發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中,水解酶能夠催化動力學拆分外消旋體得到手性產品,在工業生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來,氧化還原酶在工業上的應用得到了迅速增長。目前,采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物氧化法工業制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。

生物還原法相對于動力學拆分法而言,最大的優勢在于理論收率可達100%,原子經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與,一定程度上限制了其應用。由于輔酶依賴性的緣故,生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑,實現體內輔酶循環再生的同時免去了酶的分離純化步驟。

(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌塊，。現有的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷，難于進行工業化生產。本發明將采用生物細胞催化制備(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇。

發明內容

本發明采用黑霉菌細胞催化制備(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇，反應式如下：

2,2-二氯苯乙酮（1）經黑霉菌催化反應，得到產物(S)-2,2-二氯-1-苯乙醇（2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用黑霉菌作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%）均很高。

許多黑霉菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本發明選用黑霉菌菌株為ATCC96178，其催化反應效果最佳。

由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型,而細胞本身所含有的輔酶量可能較少,因此,進行氧化還原反應時,為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同，效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳的輔助底物。本發明經過大量實驗確定的輔助底物為：木糖30-36g/L、異丙醇7-9%V/V(體積濃度)、異丙醇8-10%V/V(體積濃度)。

由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。

培養介質：

1、　種子培養基成份為:玉米漿(以干物質計)含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L;配制固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。

2、培養液成份：玉米漿(以干物質計)含量為35-45g/L，黃豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麥芽浸膏25-30g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣0.7g/L,硫酸亞鐵0.18g/L,硫酸錳0.025g/L;pH6.3

2、固體培養基成份：在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。

黑霉菌細胞制備。黑霉菌經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27℃，將黑霉菌種子液接種至發酵罐，接種比例為10-11％，通氣比為0.9-1V/（V分鐘），26-27℃培養35-40小時，用過濾式離心機離心得到濕黑霉菌細胞，用作生物催化反應催化劑。