[發明專利]綿羊FecB基因原核表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201510551815.3
• 申請日: 2015-09-01
• 公開（公告）號: CN105063075A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 張利平;丁強;張勇;吳建平;趙生國;賈建磊;王靜;馬曉明
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種綿羊FecB基因原核表達載體的構建方法，其特征在于通過反轉錄PCR擴增FecB基因片段，反轉錄PCR擴增方法為：94℃預變性4min；94℃40s，59℃40s，72℃1min50s，35個循環，72℃10min，4℃保存；1％的瓊脂糖檢測。

2.如權利要求1所述的綿羊FecB基因原核表達載體的構建方法，其特征在于還包括有：

上游引物BamHⅠF：5’-GGATCCAACATGCTTTTGCGAAGTTC-3’，

下游引物EcoRⅠR:5’-GGAATTCCAGAGCTTAATGTCCTGGGACT-3’，

PCR擴增片段為：1509bp，上游引物是BamHⅠ和下游引物是EcoRⅠ，下方劃線為引物上添加的酶切位點。

3.如權利要求1所述的綿羊FecB基因原核表達載體的構建方法，其特征在于將雙酶切的FecB基因PCR擴增片段和經雙酶切的pET30a載體質粒T4連接酶作用下連接，轉化感受態大腸桿菌菌株；

雙酶切體系如下：BamHⅠ0.5μL，EcoRⅠ0.5μL，10×KBuffer2μL，質粒載體DNA7μL，加去離子水至20μL；37℃酶切4h；2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，切膠回收空載體和目的基因片段；用T4連接酶切后目的基因片段和空載體；連接體系：T4DNA連接酶1μL，雙酶切后的表達質粒載體1.5μL，雙酶切后目的基因片段10μL，Buffer2.5μL，加無菌水至20μL；16℃過夜連接；將連接產物加入100μL感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取白色斑點，于含卡納的液體培養基中搖床6h，菌液PCR檢測陽性克隆，提取重組質粒，雙酶切鑒定，陽性克隆。

4.如權利要求1所述的綿羊FecB基因原核表達載體的構建方法，其特征在于綿羊FecB基因編碼區(CDS)核酸序列為：