[發(fā)明專利]重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的貼壁細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510551430.7
• 申請日: 2011-05-04
• 公開（公告）號: CN105154394B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 格倫·德爾貝特·安特韋勒;大衛(wèi)·A·溫德米勒;莫尼克·吉文斯
• 申請（專利權(quán)）人: 泰爾茂比司特公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京派特恩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11270
• 代理人: 景鵬;姚開麗

本發(fā)明涉及直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長的貼壁細(xì)胞的方法。本發(fā)明還公開了一種用于將貼壁細(xì)胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集培養(yǎng)基。

本申請是2012年10月26日遞交的申請?zhí)枮?01180021315.9，發(fā)明名稱為“重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長的貼壁細(xì)胞的方法”的分案申請。

優(yōu)先權(quán)

本專利申請要求于2010年5月5日提交的臨時專利申請61/331,660的優(yōu)先權(quán)，且本專利申請是于2008年3月5日提交的美國專利申請12/042,763的部分接續(xù)申請。

背景技術(shù)

在多種處理和治療中，干細(xì)胞的使用正受到越來越多的關(guān)注。干細(xì)胞可被用于修復(fù)或替代受損或有缺陷的組織，且具有治療大范圍疾病的廣泛的臨床應(yīng)用。

細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可用于使干細(xì)胞以及其它類型的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞)生長。在細(xì)胞將要生長和分裂前，貼壁細(xì)胞需要貼附的表面。而非貼壁細(xì)胞在懸浮液中漂浮的同時進(jìn)行生長和分裂。

細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)為生長的細(xì)胞提供營養(yǎng)物且移除代謝物，以及供應(yīng)有助于細(xì)胞生長的生理化學(xué)環(huán)境。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。

生物反應(yīng)器或細(xì)胞生長腔體作為細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的組件在為擴(kuò)增的細(xì)胞提供最優(yōu)化環(huán)境中起到重要作用。在本領(lǐng)域中已知很多類型的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器裝置包括培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)、振蕩瓶(shaker flask)、攪拌槽式反應(yīng)器(stirred-tankreactor)、氣升式反應(yīng)器(air-lift reactor)和中空纖維生物反應(yīng)器。

一旦生物反應(yīng)器中擴(kuò)增的細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞覆蓋或期望的細(xì)胞數(shù)量，則需要收集細(xì)胞，且如果期望進(jìn)一步的細(xì)胞生長，則需要將細(xì)胞重新接種在相同或不同的生物反應(yīng)器中。

不管使用何種類型的生物反應(yīng)器裝置，為了收集貼壁細(xì)胞，必須首先從細(xì)胞生長的表面上移除細(xì)胞。為了從生長表面移除貼壁細(xì)胞，初始清洗細(xì)胞以移除抑制胰蛋白酶的離子(鎂、鈣)。然后將胰蛋白酶添加至經(jīng)清洗的細(xì)胞以使細(xì)胞從表面松落。一旦細(xì)胞被松落，則從膜表面移除它們，且通過清洗被移除的細(xì)胞或使它們旋轉(zhuǎn)沉淀為細(xì)胞團(tuán)、移除周圍的流體且將它們懸浮在新的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行處理以移除胰蛋白酶。

該程序容易在細(xì)胞生長在平板上的開放系統(tǒng)(諸如培養(yǎng)瓶)中進(jìn)行，其中該程序在層流凈化罩中進(jìn)行。但是在使用中空纖維生物反應(yīng)器的封閉系統(tǒng)中，該系統(tǒng)對大氣是封閉的。沒有簡單的方法來添加流體或從系統(tǒng)中移除流體，且包含在細(xì)胞生長所需的生長培養(yǎng)基中的離子由于通過中空纖維的超濾而從細(xì)胞生長空間中丟失。因此細(xì)胞存活在被稀釋的培養(yǎng)基(來自從細(xì)胞初始清洗進(jìn)入系統(tǒng)的添加的流體)、胰蛋白酶(來自用于使細(xì)胞從膜松落的胰蛋白酶)、且由于超濾培養(yǎng)基中沒有離子(例如鈣和鎂)圍繞的環(huán)境中。

這些因素可造成被直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞生長不足。

因此，需要開發(fā)新的重新接種的方案以在使用中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及用于直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長的貼壁細(xì)胞的方法，所述中空纖維生物反應(yīng)器具有內(nèi)毛細(xì)管空間(intracapillary space)和外毛細(xì)管空間(extracapillary space)，其中細(xì)胞生長空間是內(nèi)毛細(xì)管空間或外毛細(xì)管空間中的一種。該方法包括以下步驟：從所述細(xì)胞生長空間移除生長培養(yǎng)基；清洗所述細(xì)胞以從所述細(xì)胞生長空間移除殘留的生長培養(yǎng)基；通過將胰蛋白酶添加至所述細(xì)胞生長空間，使所述細(xì)胞從中空纖維生物反應(yīng)器的中空纖維上松落；從所述細(xì)胞生長空間移除細(xì)胞和所有胰蛋白酶；使來自被移除的細(xì)胞中的胰蛋白酶失活；以及，將被移除的細(xì)胞和胰蛋白酶直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞生長空間中。