[發(fā)明專利]3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510548003.3
• 申請(qǐng)日: 2015-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN105087476B
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉新農(nóng);張錦航;李天佳;王占啟;劉昌偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 欒波

本發(fā)明涉及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域，特別涉及3T3?L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化方法：3T3?L1前脂肪細(xì)胞系經(jīng)復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代后，至長滿培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36?48小時(shí)后加入含有誘導(dǎo)劑的含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化72?96小時(shí)；誘導(dǎo)劑中地塞米松0.9?1.1μM，IBMX 1.0mM，胰島素1.8?2.0μM；加入含有胰島素和胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)48?96小時(shí)；之后每48小時(shí)換液一次，自加入誘導(dǎo)劑起第8?10天成熟脂肪細(xì)胞可用。該誘導(dǎo)分化方法縮短整個(gè)3T3?L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)過程，且脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，不受細(xì)胞代數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)皿類型的影響，轉(zhuǎn)化率誤差在5％以內(nèi)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域，具體而言，涉及3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化方法。

背景技術(shù)

隨著人們生活水平的提高，肥胖及其相關(guān)疾病的發(fā)病率日益增加，由此而造成的家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)不斷加重。脂肪細(xì)胞代謝及功能紊亂是導(dǎo)致肥胖的核心機(jī)制之一，有關(guān)脂肪細(xì)胞的研究已成為目前研究熱點(diǎn)。在體外研究中，脂肪細(xì)胞模型是研究脂肪代謝及其功能的重要工具。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞系源于小鼠胎盤的成纖維細(xì)胞群，細(xì)胞形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞，呈長梭形。研究發(fā)現(xiàn)它是一種能夠增殖并在一定條件下向脂肪細(xì)胞分化的前體細(xì)胞。目前，現(xiàn)已成為誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞最為常用的細(xì)胞系。

對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞系而言，傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法是在3T3-L1前脂肪細(xì)胞融合2天后，用加入含IBMX、地塞米松、胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，后續(xù)再用含胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，之后采用普通高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，此種方法既往稱之為“雞尾酒”誘導(dǎo)法。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)“雞尾酒”誘導(dǎo)法存在誘導(dǎo)周期長、脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低且不均勻等缺點(diǎn)。此外，該誘導(dǎo)法還會(huì)受細(xì)胞的代數(shù)以及細(xì)胞培養(yǎng)皿類型的影響。如此以來，難以為研究者提供數(shù)量一致、分化穩(wěn)定的脂肪細(xì)胞。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化方法，脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，不受細(xì)胞代數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)皿類型的影響。其中，在在不同類型細(xì)胞培養(yǎng)器皿中誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率誤差在5％以內(nèi)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)分化方法，包括以下步驟：

(a)、3T3-L1前脂肪細(xì)胞系經(jīng)復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代后，至長滿培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時(shí)后進(jìn)行誘導(dǎo)分化；

(b)、所述誘導(dǎo)分化為：加入含有誘導(dǎo)劑的含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)72-96小時(shí)；其中，所述誘導(dǎo)劑各成分在所述高糖DMEM培養(yǎng)液中的終濃度為：地塞米松0.9-1.1μM，IBMX 1.0mM，胰島素1.8-2.0μM；

(c)、加入含有1.8-2.0μM胰島素和10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)48-96小時(shí)；之后每48小時(shí)換液一次，換液為含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，自加入誘導(dǎo)劑起第8-10天成熟脂肪細(xì)胞可用。

本發(fā)明提供的3T3-L1前脂肪細(xì)胞系誘導(dǎo)分化方法，參照傳統(tǒng)“雞尾酒”誘導(dǎo)法，通過延長誘導(dǎo)劑作用時(shí)間發(fā)現(xiàn)，該法可縮短整個(gè)3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的誘導(dǎo)過程，且脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，不受細(xì)胞代數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)皿類型的影響。其中，在不同類型細(xì)胞培養(yǎng)皿誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率誤差在5％以內(nèi)。

優(yōu)選地，所述復(fù)蘇為：

從液氮中取出細(xì)胞株，立即置于37±2℃水浴中，至細(xì)胞液完全溶解時(shí)取出，于室溫1000-1200rpm離心3-5min，棄去上清，加入培養(yǎng)液，吹打重懸，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)器皿中，然后將所述培養(yǎng)器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。