[發明專利]3T3-L1前脂肪細胞系的誘導分化方法

有效

• 申請號: 201510548003.3
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105087476B
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 劉新農;張錦航;李天佳;王占啟;劉昌偉
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 欒波

本發明涉及脂肪細胞誘導領域，特別涉及3T3?L1前脂肪細胞系的誘導分化方法：3T3?L1前脂肪細胞系經復蘇，培養，傳代后，至長滿培養基，繼續培養36?48小時后加入含有誘導劑的含10％胎牛血清的高糖DMEM培養液進行誘導分化72?96小時；誘導劑中地塞米松0.9?1.1μM，IBMX 1.0mM，胰島素1.8?2.0μM；加入含有胰島素和胎牛血清的高糖DMEM培養液繼續誘導48?96小時；之后每48小時換液一次，自加入誘導劑起第8?10天成熟脂肪細胞可用。該誘導分化方法縮短整個3T3?L1前脂肪細胞系的誘導過程，且脂肪細胞轉化率穩定，不受細胞代數及細胞培養皿類型的影響，轉化率誤差在5％以內。

技術領域

本發明涉及脂肪細胞誘導領域，具體而言，涉及3T3-L1前脂肪細胞系的誘導分化方法。

背景技術

隨著人們生活水平的提高，肥胖及其相關疾病的發病率日益增加，由此而造成的家庭及社會經濟負擔不斷加重。脂肪細胞代謝及功能紊亂是導致肥胖的核心機制之一，有關脂肪細胞的研究已成為目前研究熱點。在體外研究中，脂肪細胞模型是研究脂肪代謝及其功能的重要工具。

3T3-L1前脂肪細胞系源于小鼠胎盤的成纖維細胞群，細胞形態上類似成纖維細胞，呈長梭形。研究發現它是一種能夠增殖并在一定條件下向脂肪細胞分化的前體細胞。目前，現已成為誘導分化為脂肪細胞最為常用的細胞系。

對3T3-L1前脂肪細胞系而言，傳統誘導方法是在3T3-L1前脂肪細胞融合2天后，用加入含IBMX、地塞米松、胰島素的培養基培養2天，后續再用含胰島素的培養基培養2天，之后采用普通高糖DMEM培養基培養，此種方法既往稱之為“雞尾酒”誘導法。隨著研究的深入，發現傳統“雞尾酒”誘導法存在誘導周期長、脂肪細胞轉化率低且不均勻等缺點。此外，該誘導法還會受細胞的代數以及細胞培養皿類型的影響。如此以來，難以為研究者提供數量一致、分化穩定的脂肪細胞。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種3T3-L1前脂肪細胞系的誘導分化方法，脂肪細胞轉化率穩定，不受細胞代數及細胞培養皿類型的影響。其中，在在不同類型細胞培養器皿中誘導的脂肪細胞的轉化率誤差在5％以內。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

3T3-L1前脂肪細胞系的誘導分化方法，包括以下步驟：

(a)、3T3-L1前脂肪細胞系經復蘇，培養，傳代后，至長滿培養基，繼續培養36-48小時后進行誘導分化；

(b)、所述誘導分化為：加入含有誘導劑的含10％胎牛血清的高糖DMEM培養液，培養72-96小時；其中，所述誘導劑各成分在所述高糖DMEM培養液中的終濃度為：地塞米松0.9-1.1μM，IBMX 1.0mM，胰島素1.8-2.0μM；

(c)、加入含有1.8-2.0μM胰島素和10％胎牛血清的高糖DMEM培養液繼續誘導48-96小時；之后每48小時換液一次，換液為含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基，自加入誘導劑起第8-10天成熟脂肪細胞可用。

本發明提供的3T3-L1前脂肪細胞系誘導分化方法，參照傳統“雞尾酒”誘導法，通過延長誘導劑作用時間發現，該法可縮短整個3T3-L1前脂肪細胞系的誘導過程，且脂肪細胞轉化率穩定，不受細胞代數及細胞培養皿類型的影響。其中，在不同類型細胞培養皿誘導的脂肪細胞的轉化率誤差在5％以內。

優選地，所述復蘇為：

從液氮中取出細胞株，立即置于37±2℃水浴中，至細胞液完全溶解時取出，于室溫1000-1200rpm離心3-5min，棄去上清，加入培養液，吹打重懸，將細胞懸液加入培養器皿中，然后將所述培養器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒溫培養箱中培養。