[發(fā)明專利]可特異性結(jié)合抗玉米赤霉烯酮抗體的納米抗體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510546912.3
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105218675B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 許楊;何慶華;王顯顯
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13;G01N33/64
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及可特異性結(jié)合抗玉米赤霉烯酮抗體的納米抗體制備及其應用,其氨基酸序列SEQ ID NO.:1，還涉及編碼該氨基酸的核苷酸。本發(fā)明納米抗體可以替代價格昂貴且具有毒性的ZEN標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于ZEN的免疫學檢測，該納米抗體具有與天然ZEN分子相似的免疫反應特性，效果良好。納米抗體相比于傳統(tǒng)的基于多肽的抗原模擬表位及基于IgG的傳統(tǒng)抗獨特型抗體，具有結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、耐酸堿和高溫、檢測靈敏度高等特性，因此其免疫檢測穩(wěn)定性得到了極大的提升，同時對環(huán)境的耐受能力也得到了提升。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及可特異性結(jié)合抗玉米赤霉烯酮抗體(anti-zearalenone Monoclonal antibody,anti-ZEN McAb)的納米抗體(Variable domain ofheavy chain of heavychain antibody,VHH)制備及其應用。

背景技術(shù)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素樣真菌毒素，其化學名為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯161～163℃，不溶于水，溶于堿性溶液、乙醚、苯、甲醇以及乙醇等。玉米赤霉烯酮廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、燕麥、大麥等谷類作物以及奶中。產(chǎn)生玉米赤霉烯酮最常見菌屬是禾谷鐮刀菌，此外為三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等。ZEN具有類雌激素樣作用、生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、細胞毒性、肝毒性，對腫瘤產(chǎn)生也有一定影響，因此谷物在田間、收獲及在儲存過程中一旦被ZEN污染，不僅會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，更重要的是可能對人類和動物的健康造成嚴重的危害，因此對食品中ZEN的檢測具有重要意義。

目前比較常用的檢測ZEN方法有:高效液相色譜法，氣相色譜法，薄層層析法，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，免疫檢測法等，但以免疫學檢測方法較為方便、實用，適合于大規(guī)模樣品的快速檢測。免疫學檢測方法往往涉及到使用毒素小分子標準品來建立標準曲線。用標準品的劣勢首先在于毒素小分子提取工作困難，現(xiàn)在我國大多使用進口產(chǎn)品，而且某些產(chǎn)品進口受限，這樣相對增加了成本，最重要的是毒素分子標準品的使用很容易造成環(huán)境的污染和對操作人員身體的危害。因此，人們開始利用抗獨特型抗體和抗原模擬表位來實現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術(shù)的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，并且在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位等方面應用廣泛。

本發(fā)明通過用噬菌體展示技術(shù)，從駝源天然單域重鏈抗體庫中篩選能與靶分子(抗ZEN單克隆抗體)特異性結(jié)合的納米抗體(VHH)，以納米抗體作為ZEN抗原的替代物應用于免疫學分析檢測領域。該方法避免了傳統(tǒng)抗獨特型抗體制備所需的動物免疫過程，且具有普遍適用性，篩選得到的納米抗體具有與天然ZEN分子相似的免疫反應特性，可替代價格昂貴且毒性強的ZEN標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于ZEN的免疫學檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以抗ZEN單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，投入駝源天然單域重鏈抗體庫進行親和淘選，獲得了一種可特異性結(jié)合抗ZEN單克隆抗體的納米抗體(Z1)，其具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的IMGT編號和結(jié)構(gòu)域劃分如圖1所示。

本發(fā)明所提及的納米抗體包括四個框架區(qū)(Framework region,FR)和三個互補決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)。其中，框架區(qū)(FR1-FR4)分別選自SEQID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8，互補決定區(qū)(CDR1-CDR3)分別選自SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7。框架區(qū)結(jié)構(gòu)相對保守，主要起著維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；互補決定區(qū)結(jié)構(gòu)相對多樣化，主要負責抗體的識別。